馮　虎，劉　念，孟祥寬，陳玉丙，王　欣

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.放療科；2.檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130041;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

?

FXR蛋白在肝癌組織中的表達(dá)情況

馮虎1，劉念3，孟祥寬1，陳玉丙1，王欣2*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 1.放療科；2.檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春130041;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

我國(guó)肝癌發(fā)病率居全球首位，患者在確診后即使經(jīng)過(guò)治療，僅有19%的患者能存活一年，Yang[1]發(fā)現(xiàn)FXR基因敲出的27只大于15個(gè)月齡的小鼠全部自發(fā)肝臟腫瘤，而同月齡的17只野生鼠無(wú)腫瘤發(fā)生，首次證實(shí)了FXR與肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。同年Kim[2]報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)果，在12個(gè)月齡的FXR基因敲除小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)了腺瘤、肝細(xì)胞癌及肝膽管細(xì)胞癌，進(jìn)一步證實(shí)了FXR的缺乏將導(dǎo)致小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生?？梢?jiàn)FXR缺失與肝癌發(fā)生具有密切關(guān)系，這與FXR對(duì)機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控密不可分。而FXR在人類(lèi)肝癌組織中的表達(dá)情況仍罕見(jiàn)報(bào)道。為了解FXR在人肝癌組織及正常組織的表達(dá)情況，我們收集了6例術(shù)后的肝癌組織及周?chē)＝M織標(biāo)本，通過(guò)Western blot法檢測(cè)FXR蛋白表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1患者和肝臟樣本選取2014-2015年間就診于吉林大學(xué)第二醫(yī)院肝膽外科的6例接受根治性肝葉切除術(shù)治療的患者。其中，男性3例，女性3例，年齡小于50歲的3例，大于或等于50歲的3例。6例患者經(jīng)病理確診為肝細(xì)胞癌，其中IIA期3例，IIIA期3例。這些患者在手術(shù)前未進(jìn)行任何局部或全身治療。腫瘤樣品從腫瘤的無(wú)壞死區(qū)取出，癌旁正常肝組織樣品在腫瘤外3 cm處取得。所得樣品立即放于-80℃液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑：兔抗人FXR單克隆抗體(Abbiotec，購(gòu)自深圳市豪地華拓生物科技有限公司)FITC Goat Anti-Rabbit IgG(HL)(貨號(hào)ASO11，購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1Western blot分析分別取肝癌組織及癌旁正常組織約30 mg研磨后加200 μl裂解液進(jìn)行裂解。用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各取100 μg在12% SDS—聚丙烯酰胺凝膠上跑電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜、用脫脂奶粉封閉、孵一抗(1∶1 000)、洗一抗、孵二抗(1∶1 000)、洗二抗，加ECL顯色。1.2.2結(jié)果判定觀察肝癌和癌旁組織中FXR蛋白表達(dá)的高低，并使用IMAGE J軟件處理圖像得到灰度值，并計(jì)算出目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值作為相對(duì)灰度值，以相對(duì)灰度值作為結(jié)果分析數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Excel表格收集數(shù)據(jù)，應(yīng)用Shapiro-Wilk統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)肝癌組織及癌旁組織兩組的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。由于癌旁組織的Western結(jié)果分析得到相對(duì)灰度值這一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，所以上述兩組數(shù)據(jù)采用兩配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法，分析肝癌和癌旁組織中FXR表達(dá)的差異，全部統(tǒng)計(jì)過(guò)程通過(guò)SPSS21.0實(shí)現(xiàn)。

2結(jié)果

2.1FXR蛋白在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)通過(guò)Western blot法檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)FXR蛋白在肝細(xì)胞癌組織(T)中的表達(dá)量比癌旁組織(N)中的表達(dá)量低(見(jiàn)圖1)。

圖1　6例HCC患者癌組織和癌旁組織樣本FXR蛋白表達(dá)情況

2.2Western blot圖像的相對(duì)灰度值分析使用IMAGE J軟件對(duì)肝癌組織(T)和癌旁組織(N)的Western結(jié)果分析得到相對(duì)灰度值(見(jiàn)圖2)。將6例患者的肝癌組織與癌旁組織Western結(jié)果分析得到相對(duì)灰度值分別進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：癌旁組織的Western結(jié)果分析得到相對(duì)灰度值這一組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，而肝癌組織所得到的數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布(見(jiàn)表1)。故將6例患者的肝癌組織與癌旁組織組成配對(duì)資料，使用兩配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法分析肝癌組織與癌旁組織FXR表達(dá)量的差異，差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，F(xiàn)XR在肝癌組織中的表達(dá)與癌旁組織相比顯著降低(見(jiàn)表2)。

圖2　用相對(duì)灰度值量化Western blot結(jié)果

Shapiro-Wilk統(tǒng)計(jì)量DfsigT0.92960.575*N0.76260.026

注：*符合正態(tài)分布，P>0.05。

表2　　　　肝癌組織與癌旁組織FXR表達(dá)量的兩配對(duì)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)的結(jié)果

注：肝癌組織組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，使用Mean±S表示；癌旁組織組的數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故使用median,Q表示。Mean ：平均值；S： 標(biāo)準(zhǔn)差；median：中值；Q：四分位數(shù)間距。*：P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

FXR在生物體內(nèi)非常普遍，是維持機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)所需的物質(zhì)。FXR可能通過(guò)以下方式發(fā)揮保肝作用：維持正常的膽汁酸、糖、脂代謝的動(dòng)態(tài)平衡[3,4]，促進(jìn)肝細(xì)胞再生[5]，通過(guò)抑制NF-κB-和STAT3-介導(dǎo)的信號(hào)通路反調(diào)節(jié)肝臟炎癥[6]，誘導(dǎo)的腫瘤抑制基因的表達(dá)并且抑制癌基因的轉(zhuǎn)錄[7]。因此，F(xiàn)XR活性的損失可能成為肝癌的發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要的分子事件。本實(shí)驗(yàn)用Western blot法比較了6例術(shù)后的肝癌組織及周?chē)＝M織標(biāo)本FXR蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR蛋白在癌組織的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織。

然而，肝癌的發(fā)展過(guò)程中FXR的表達(dá)下調(diào)的精確分子機(jī)制至今仍然不清楚。炎癥可能為減少FXR的表達(dá)提供了一個(gè)微環(huán)境，Liu[8]在大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者中升高的促炎細(xì)胞因子，如TNFα，IL-1β和IL-6，可能通過(guò)抑制FXR基因啟動(dòng)子降低FXR的表達(dá)。表觀遺傳沉默是FXR表達(dá)的減少的另一個(gè)重要因素。Zhang[9]證明了miR-421通過(guò)靶向肝細(xì)胞癌中FXR mRNA的3′UTR抑制FXR的轉(zhuǎn)錄。

因此，我們需要進(jìn)一步研究證實(shí)FXR與其他轉(zhuǎn)錄因子、炎癥因子以及激素之間的交互調(diào)控作用，闡明FXR與機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制，進(jìn)而揭示FXR與腫瘤細(xì)胞增值以及癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，從而為腫瘤治療新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、新策略的制定提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yang F,Huang X,Yi T,et al.Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor[J].Cancer Res，2007，67(3):863.

[2]Kim I,Morimura K,Shah Y,et al.Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice[J].Carcinogenesis，2007，28(5):940.

[3]Inagaki T,Choi M,Moschetta A,et al.Fibroblast growth factor 15 functions as an enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis[J].Cell Metab，2005，2(4):217.

[4]Claudel T,Staels B,Kuipers F.The Farnesoid X receptor:a molecular link between bile acid and lipid and glucose metabolism[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(10):2020.

[5]Huang W,Ma K,Zhang J,et al.Nuclear receptor-dependent bile acid signaling is required for normal liver regeneration[J].Science,2006,312(5771):233.

[6]Grivennikov SI,Karin M.Dangerous liaisons:STAT3 and NF-kappaB collaboration and crosstalk in cancer[J].Cytokine Growth Factor Rev,2010,21(1):11.

[7]Chen Y,Song X,Valanejad L,et al.Bile salt export pump is dysregulated with altered farnesoid X receptor isoform expression in patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2013,57(4):1530.

[8]Liu N,Meng Z,Lou G,et al.Hepatocarcinogenesis in FXR-/- mice mimics human HCC progression that operates through HNF1alpha regulation of FXR expression[J].Mol Endocrinol,2012,26(5):775.

[9]Zhang Y,Gong W,Dai S,et al.Downregulation of human farnesoid X receptor by miR-421 promotes proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells[J].Mol Cancer Res,2012,10(4):516.

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0999-03

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：201215072)

*通訊作者

(收稿日期：2015-12-16)