肖曉光,李艷蓮，孫國(guó)華

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 大連116011)

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銅綠假單胞菌整合子系統(tǒng)與多重耐藥關(guān)系的探討

肖曉光,李艷蓮，孫國(guó)華*

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科,遼寧 大連116011)

摘要：目的檢測(cè)多重耐藥的銅綠假單胞菌中整合子系統(tǒng)的分布和耐藥基因攜帶情況，并探討整合子系統(tǒng)的分布與多重耐藥的關(guān)系。方法選取2012年5月至2012年10月由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者各種標(biāo)本中分離的多重耐藥的銅綠假單胞菌148株，提取全基因組DNA，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子和相關(guān)耐藥基因bla CTX-M、bla SHV、bla VIM、bla IMP、OPrD2、aadA、aadB，并通過(guò)凝膠電泳方法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果在多重耐藥的銅綠假單胞菌中I類(lèi)整合子陽(yáng)性檢出率為 56.1% (83/148)；未檢測(cè)到Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合子；在整合子陽(yáng)性的多重耐藥的銅綠假單胞菌中，耐藥基因blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB檢出率分別為39.8%、28.9%、25.3%、31.3%和27.7%，和整合子陰性的多重耐藥的銅綠假單胞菌比較均存在顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論整合子系統(tǒng)在多重耐藥的非發(fā)酵菌屬的銅綠假單胞菌中檢出率很高，它的存在是銅綠假單胞菌產(chǎn)生多重耐藥的一個(gè)重要因素。

關(guān)鍵詞：多重耐藥；整合子；銅綠假單胞菌；耐藥基因

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0966)

多重耐藥菌定義為一種微生物對(duì)三類(lèi)或三類(lèi)以上抗生素同時(shí)耐藥?？股氐膹V泛和不限制應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌的多重耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重[1]。近年來(lái)，該問(wèn)題已逐步引起了全球范圍的關(guān)注，耐藥菌株的快速出現(xiàn)與細(xì)菌抗生素耐藥基因的獲得和播散密切相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的主要方式為細(xì)菌之間基因的水平傳遞，從而從環(huán)境中獲得耐藥基因，并已證實(shí)了整合子是耐藥基因儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)移的重要結(jié)構(gòu)[2]，因此對(duì)整合子的臨床監(jiān)測(cè)是十分必要的。

銅綠假單胞菌為臨床上分離陽(yáng)性率較高的非發(fā)酵菌屬的細(xì)菌，且常呈多重耐藥的特點(diǎn)，這給臨床抗感染治療帶來(lái)了很大的困難。因此，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑選了臨床多重耐藥的銅綠假單胞菌進(jìn)行整合子系統(tǒng)和相關(guān)耐藥基因blaCTX-M、blaSHV、blaVIM、blaIMP、OPrD2、aadA、aadB的檢測(cè)，并對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，探討了整合子系統(tǒng)與多重耐藥菌株傳播的關(guān)系。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源從2012年5月至2012年10月由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院患者各種標(biāo)本中分離所得251株銅綠假單胞菌，無(wú)重復(fù)株。

陰性對(duì)照菌株：標(biāo)準(zhǔn)銅綠假單胞菌菌株(ATCC27853),由大連市臨床檢驗(yàn)中心提供。

整合子I、II、III型陽(yáng)性菌株：由衛(wèi)生部北京醫(yī)院提供。

blaCTX-M、blaSHV、blaVIM、blaIMP、OPrD2、aadA、aadB基因陽(yáng)性菌株：無(wú)錫市克隆遺傳研究所提供。

1.2標(biāo)本的處理及保存實(shí)驗(yàn)室對(duì)標(biāo)本的采集和處理均按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)菌株均于-80℃保存。

1.3試劑和儀器

1.3.1試劑MH瓊脂、美洛培南(MEM，10μg)紙片、米諾環(huán)素(MH，10μg)紙片均為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。

細(xì)菌DNA提取試劑盒(MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0)由大連寶生物公司提供。

整合子I、II、III型基因擴(kuò)增試劑盒為大連寶生物公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1　整合子I、II、III型基因引物序列

blaCTX-M、blaSHV、blaVIM、blaIMP、OPrD2、aadA、aadB基因擴(kuò)增試劑盒為無(wú)錫市克隆遺傳研究所提供。

1.3.2儀器

全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)WalkAway96由美國(guó)德靈公司生產(chǎn)。

全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀Tanon-3500由上海天能科技有限公司生產(chǎn)。

基因擴(kuò)增儀system9700由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。

1.4方法

1.4.1耐藥菌株的篩選通過(guò)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)WalkAwayScan96，對(duì)菌株進(jìn)行鑒定和進(jìn)行藥敏分析，通過(guò)K-B紙片法對(duì)美洛培南和米諾環(huán)素補(bǔ)充藥物敏感性試驗(yàn)，篩選多重耐藥菌株，對(duì)三類(lèi)或三類(lèi)以上抗生素同時(shí)耐藥判定為多重耐藥。

1.4.2耐藥株的整合子系統(tǒng)的檢測(cè)①細(xì)菌DNA的提取挑取單個(gè)菌落于1.5ml生理鹽水中，35℃孵育過(guò)夜。離心棄上清，使用由大連寶生物工程有限公司提供的細(xì)菌提取試劑盒(MiniBESTBacterialGenomicDNAExtractionKitVer.2.0)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA的小量純化，按照說(shuō)明進(jìn)行操作。②擴(kuò)增整合子系統(tǒng)和耐藥基因擴(kuò)增條件均如下：PCR反應(yīng)體系為50μl：PremixTaq25μl,DNA模板 3μl,20μM引物 2μl,滅菌蒸餾水20μl。擴(kuò)增條件：94℃ 5min，然后94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，共30個(gè)循環(huán)。72℃ 10min。③電泳結(jié)果檢測(cè)及分析結(jié)果檢測(cè)：配置0．8%瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm，電泳30min。結(jié)果分析：使用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀Tanon-3500觀(guān)察電泳結(jié)果。

1.4.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)χ2檢驗(yàn)對(duì)各組間差異性進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1251株銅綠假單胞菌中檢出多重耐藥菌株148株，占59.0%。

2.2多重耐藥的銅綠假單胞菌中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型整合子檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2　多重耐藥的銅綠假單胞菌中整合子檢測(cè)陽(yáng)性菌株分布

2．3整合子系統(tǒng)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　整合子I PCR擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果

2.4部分耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2、3、4。

圖2　耐藥基因VIM擴(kuò)增結(jié)果

圖3　耐藥基因bla SHV擴(kuò)增結(jié)果

2.5多重耐藥的銅綠假單胞菌整合子陽(yáng)性菌株和陰性菌株的耐藥率比較

I類(lèi)整合子陽(yáng)性多重耐藥的銅綠假單胞菌對(duì)美洛培南、頭孢哌酮/舒巴坦、環(huán)丙沙星、亞胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率明顯高于陰性組，兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

圖4　耐藥基因aadA擴(kuò)增結(jié)果

表3　銅綠假單胞菌整合子陽(yáng)性菌株和陰性菌株的耐藥率分析

2.6多重耐藥的銅綠假單胞菌整合子陽(yáng)性菌株和陰性菌株的耐藥基因比較

I類(lèi)整合子陽(yáng)性多重耐藥的銅綠假單胞菌blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB檢出率明顯高于陰性組，兩者比較差異有顯著性意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4　銅綠假單胞菌整合子陽(yáng)性菌株和陰性菌株的耐藥基因分布

3討論

當(dāng)今細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已經(jīng)成為世界范圍關(guān)注的問(wèn)題，通過(guò)研究普遍認(rèn)為當(dāng)前細(xì)菌廣泛產(chǎn)生耐藥性的原因主要是通過(guò)菌株之間的耐藥基因的傳播引起的，而整合子系統(tǒng)的研究進(jìn)一步證實(shí)了它是細(xì)菌耐藥基因儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)移的重要結(jié)構(gòu)。根據(jù)整合子基因序列的不同，可以將整合子可以分為6類(lèi)，目前對(duì)前3類(lèi)整合子的研究最為普遍，其中最常見(jiàn)的是第I類(lèi)整合子[3]。

近年來(lái)，國(guó)外大量文獻(xiàn)針對(duì)整合子和轉(zhuǎn)座子可介導(dǎo)細(xì)菌各種耐藥基因方面均有報(bào)道。多重耐藥的發(fā)生是由于整合子通常通過(guò)首尾相接的方式整合一個(gè)或多個(gè)耐藥基因盒[4]，形成多重耐藥性，對(duì)人們的健康造成嚴(yán)重的威脅。整合子是細(xì)菌基因捕獲和表達(dá)的一種可移動(dòng)的遺傳單位，它定位于細(xì)菌染色體和具有廣泛宿主的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，可攜帶位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[5，6]，能整合不同的耐藥基因盒，醫(yī)院環(huán)境下的臨床菌株在更大的抗生素選擇性的壓力下，耐藥基因盒就更容易被整合。細(xì)菌可以利用整合子隨機(jī)靈活地?cái)z取和切除耐藥基因，以對(duì)抗抗生素的壓力而生存，是細(xì)菌有效、方便且不危險(xiǎn)的存活機(jī)制。

銅綠假單胞菌是引起院內(nèi)感染的最常見(jiàn)的病原菌，近年來(lái)銅綠假單胞菌的耐藥性也在不斷的上升[7]，且呈現(xiàn)多重耐藥的趨勢(shì)。本研究的251株銅綠假單胞菌中多重耐藥株為148株，占59%，說(shuō)明多重耐藥的銅綠假單胞菌已成為大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床常見(jiàn)分離菌。

通過(guò)對(duì)148株多重耐藥的銅綠假單胞菌整合子分布情況檢測(cè)可知：在多重耐藥的銅綠假單胞菌中有83株含有I類(lèi)整合子，占56.1%，而未檢出II、III類(lèi)整合子，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道結(jié)果基本一致[8，9]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在整合子陽(yáng)性的多重耐藥的銅綠假單胞菌中，耐藥基因blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB檢出率分別為39.8%、28.9%、25.3%、31.3%和27.7%，和整合子陰性的多重耐藥的銅綠假單胞菌比較兩者差異性顯著(P<0.05)。其中blaSHV基因是編碼β-內(nèi)酰胺酶和的基因，引起銅綠假單胞菌對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)等β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物耐藥；blaVIM和blaIMP基因是編碼碳青霉烯酶的基因，是引起銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的原因；aadA是編碼氨基糖腺苷轉(zhuǎn)移酶的基因，aadB是編碼氨基糖苷類(lèi)乙?；D(zhuǎn)移酶的基因，引起銅綠假單胞菌對(duì)慶大霉素、妥布霉素的耐藥。這與我們通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的：I類(lèi)整合子陽(yáng)性多重耐藥的銅綠假單胞菌對(duì)美洛培南、亞胺培南、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率明顯高于陰性組的結(jié)論相吻合，說(shuō)明blaVIM、blaSHV、blaIMP、aadA、aadB等耐藥基因盒易被整合子系統(tǒng)所捕獲，整合于I類(lèi)整合子上，存在于整合子陽(yáng)性的銅綠假單胞中。另外，在整合子陰性的菌株中也存在一定比例的上述耐藥基因，說(shuō)明這些耐藥基因還可以以其它方式存在于銅綠假單胞菌中。

此外，blaCTX-M基因是編碼對(duì)頭孢噻肟和頭孢曲松具有較高水解能力的β-內(nèi)酰胺酶的基因；OprD2是導(dǎo)致外膜通道蛋白缺失的基因，也是引起銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的原因[10]。這兩者在整合子陽(yáng)性和陰性的多重耐藥的銅綠假單胞菌中的分布沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明這了兩種耐藥基因可能不存在于我院檢出的銅綠假單胞菌的整合子基因盒上，而是以其它方式存在與銅綠假單胞菌中，也是引起我院銅綠假單胞菌對(duì)頭孢菌素高耐藥率的一個(gè)重要原因。

總之，通過(guò)對(duì)臨床上多重耐藥的銅綠假單胞菌的整合子篩查，以及對(duì)其耐藥基因攜帶的檢測(cè)結(jié)果表明，整合子系統(tǒng)在非發(fā)酵菌屬的銅綠假單胞菌中檢出率很高，它的存在是銅綠假單胞菌產(chǎn)生多重耐藥的一個(gè)重要因素。病房應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌的耐藥監(jiān)測(cè)及合理選擇抗菌藥物，控制細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和在院內(nèi)的傳播。

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基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳高等學(xué)校科研項(xiàng)目(L2010104)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0966-04

中圖分類(lèi)號(hào)：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：肖曉光(1971-)女，主任技師，研究方向：微生物及基因診斷學(xué)。

(收稿日期：2013-10-15)

InvestigationonrelationshipbetweenintegronsinP.Aeruginosaandmulti-drugresistant

XIAO Xiao-guang,LI Yan-lian,SUN Guo-hua.

(Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,Dalian Medical University,Dalian 116011,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the carrying situation of integron multi-drug resistant PA and to analyze its association with multiple drug resistance.Methods148 multi-drug resistant PA strains isolated from specimens of hospitalized patients in First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,during May,2012 to October,2012,extracted entire genome,analyzed the PCR product of class Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ integrons and related resistant genes:bla CTX-M、bla SHV,bla VIM,bla IMP,OPrD2,aadA and aadB.ResultsIn multi-drug resistant PA,positive rate of class I integron is 56.1% ( 83 / 148 );no detectable class II and class III integron were found;positive rates of blaVIM,blaSHV,blaIMP，aadA，aadB are 39.8%，28.9%，25.3%，31.3% and 27.7%,which has significant differences with integron negative PA(P<0.05).ConclusionIntegron exists prevalently in PA,its existence is an important factor for PA to perform multiple drug resistance

Key words:multi-drug resistant;integron;drug resistant gene