陳　鑫，韓　霜，臧素綱，楊萍燦，汪曉鶯，周玉貴*

(1.南通大學(xué)附屬東臺(tái)醫(yī)院 檢驗(yàn)科,江蘇 東臺(tái)224200;2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，江蘇 南通226001)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-7方法的建立及臨床初步應(yīng)用

陳鑫1，韓霜1，臧素綱1，楊萍燦1，汪曉鶯2，周玉貴1*

(1.南通大學(xué)附屬東臺(tái)醫(yī)院 檢驗(yàn)科,江蘇 東臺(tái)224200;2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室，江蘇 南通226001)

摘要：目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)血清miR-7，并作臨床初步應(yīng)用。方法用Trizol試劑提取血清總RNA。miR-7 ploy(A)聚合酶加尾逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。制作C.elegans-miR-39模擬物濃度梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線，絕對(duì)定量血清中miR-7的表達(dá)水平。結(jié)果該方法能定量檢測(cè)血清miR-7表達(dá)水平，熔解曲線呈單峰，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異，在103copies/uL至106copies/uL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(r2=0.995)，并且檢測(cè)重復(fù)性好。糖尿病患者血清中miR-7表達(dá)水平明顯高于健康體檢者(P<0.05)。結(jié)論所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能敏感、特異地檢測(cè)血清中miR-7的表達(dá)水平，為下一步臨床應(yīng)用的研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR；miR-7；糖尿病

(Chin J Lab Diagn,2016,20:0959)

microRNAs(miRNAs)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一類分布廣泛的小分子RNA。它們基于與靶mRNA的序列互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，可以降解靶mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯。作為一種新型基因表達(dá)調(diào)控因子，miRNAs參與生命過程中一系列的重要生物學(xué)進(jìn)程，包括個(gè)體發(fā)育、器官形成、干細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等[1-3]。隨著研究的不斷深入，miRNAs與疾病之間的關(guān)系也趨于明朗化，已成為目前臨床應(yīng)用研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。有報(bào)道表明，miR-7是胰島組織內(nèi)表達(dá)最豐富的內(nèi)分泌miRNA[4]，參與胰島的發(fā)育和胰島素合成，提示其在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中可能扮演重要角色。因此，血清miR-7表達(dá)水平的檢測(cè)是其臨床應(yīng)用研究首當(dāng)其沖需解決的問題。

據(jù)此，本研究建立了ploy(A)聚合酶加尾的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法。應(yīng)用此種方法檢測(cè)血清標(biāo)本中miR-7的表達(dá)水平，初步探索是否能將miR-7作為糖尿病診斷的新型生物學(xué)標(biāo)志物。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象收集2012年6月至2013年6月南通大學(xué)附屬東臺(tái)醫(yī)院糖尿病患者118例，其中男59例，女59例，年齡26-88歲，均經(jīng)WHO(1999年)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診，病程數(shù)月到數(shù)年不等。同期健康體檢者106例作為對(duì)照組，其中男52例，女54例，年齡28-84歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2樣本采集所有研究對(duì)象于清晨空腹采集靜脈血3-5ml。分離血清后分裝至-80℃恒溫冰箱保存。

1.3主要試劑與儀器Trizol溶解試劑、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、TaqDNA聚合酶、內(nèi)含SYBRGreenI熒光染料的PCR緩沖液、焦炭酸二乙酯(DEPC)、TAE緩沖液、溴化乙錠(EB)、離心管(南通碧云天技術(shù)研究所)，無水乙醇、氯仿、異丙醇(無錫展望化工試劑有限公司)，100bpDNALadderMarker(大連寶生物工程有限公司)。RotorGeneQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀(德國(guó)QIAGEN公司)、HC-2518R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、SMA1000微量紫外分光光度計(jì)(北京美林恒通公司)、DYY-III8A型穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀(北京六一儀器廠)、DH-2000凝膠成像系統(tǒng)(北京華電公司)、BSC-1500ⅡA2X型生物安全柜(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)。

1.4引物設(shè)計(jì)和合成根據(jù)miRBASE(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中hsa-miR-7(UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU)的序列，設(shè)計(jì)其特異性poly(A)加尾逆轉(zhuǎn)錄引物和PCR擴(kuò)增引物。線蟲C.elegans-miR-39的模擬物、內(nèi)參hsa-miR-15a及其引物均由德國(guó)QIAGEN公司設(shè)計(jì)合成(公司未予公開)。

1.5血清總RNA提取取200μL復(fù)溶的血清于離心管中，加入Trizol溶解試劑，充分混勻裂解；之后分別用氯仿、異丙醇及DEPC水配制的乙醇，并結(jié)合硅膠膜特異性吸附作用來分離和純化RNA。RNA從離心管硅膠膜上洗脫溶于DEPC水中。通過測(cè)定計(jì)算RNA溶液260nm和280nm的紫外吸收值的比值(A260/A280)確認(rèn)RNA濃度和純度。

1.6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系體積為20μL，包括總RNA樣本、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、DEPC水。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：37℃60min，95℃5min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA于-80 ℃保存。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系體積為20μL，包括miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA、dNTP混合物、miR-7上游特異引物、下游通用引物、TaqDNA聚合酶、PCR緩沖液(內(nèi)含SYBRGreenI熒光染料)、DEPC水。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性15min；94℃變性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。以同樣的反應(yīng)體系和hsa-miR-15a特異性引物進(jìn)行內(nèi)參hsa-miR-15a熒光定量。以DEPC水代替逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為陰性對(duì)照。

1.8標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將人工合成的C.elegans-miR-39的miRNA模擬物以DEPC水稀釋8個(gè)數(shù)量級(jí)，即101、102、103、104、105、106、107以及108copies/μL，分別取每一數(shù)量級(jí)稀釋液2μl與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以及PCR擴(kuò)增檢測(cè)，每反應(yīng)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增后根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)定統(tǒng)一閾值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)的CT平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本的CT值計(jì)算出該血清標(biāo)本miR-7的絕對(duì)濃度，為絕對(duì)定量法。

1.9PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳配制2%的瓊脂糖凝膠，加入溴化乙錠(EB)溶液至終濃度0.5μg/mL，80V恒壓電泳40min，待溴酚藍(lán)跑到2/3位置處停止電泳，紫外燈下觀察產(chǎn)物的有無及大小。

2結(jié)果

2.1血清總RNA抽提及純度檢測(cè)的結(jié)果

經(jīng)測(cè)量計(jì)算，所有標(biāo)本提取RNA溶液的A260/A280比值(1.916±0.089)均在1.8-2.1范圍內(nèi)，表明RNA純度較好，可以用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2熔解曲線及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳驗(yàn)證

如圖1所示，熔解曲線呈單峰，未見雜峰信號(hào)，熔解溫度約為77℃。表明逆轉(zhuǎn)錄PCR參數(shù)選擇適當(dāng)，產(chǎn)物特異性較好。poly(A)聚合酶加尾法逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小應(yīng)約為85bp-87bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，可見明亮、清晰的電泳條帶，與預(yù)期大小一致，如圖2所示。

2.3熒光定量PCR法的檢測(cè)重復(fù)性試驗(yàn)

任取1份糖尿病患者血清標(biāo)本的RNA抽提溶液，在1次熒光定量PCR中設(shè)置10個(gè)平行孔進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV)。結(jié)果顯示：miR-7的拷貝數(shù)為(111.49±3.99)×103copies/uL，批內(nèi)CV為3.58%。對(duì)同1份標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)10次熒光定量PCR的檢測(cè)，計(jì)算批間變異系數(shù)(CV)。結(jié)果顯示：miR-7的拷貝數(shù)為(107.94±5.71)×103copies/uL，批間CV為5.29%。

圖1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

圖2　逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

2.4檢測(cè)miR-7時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖3所示，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品C.elegans-miR-39模擬物的擴(kuò)增曲線呈S型。在103copies/uL至106copies/uL的范圍內(nèi)CT值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度呈良好線性關(guān)系，r2為0.995，制作成標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。

圖3　103至106copies/uL4個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線

2.5miR-7在糖尿病患者及健康體檢者血清中檢測(cè)結(jié)果的比較

118例糖尿病患者和106例健康體檢者的血清標(biāo)本均可見擴(kuò)增曲線，但表達(dá)程度不同，見圖5。由表1可見，糖尿病患者和健康體檢者血清中miR-7的表達(dá)水平分別為(21.01±12.90)×103copies/uL和(2.65±1.18)×103copies/uL，糖尿病患者血清miR-7的表達(dá)水平高于健康體檢者。經(jīng)Mann-whitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。

圖4　檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5　　　　部分糖尿病患者及健康體檢者血清中miR-7熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

組別n平均Ct值平均拷貝數(shù)(103copies/uL)糖尿病患者11826.81±3.6221.01±12.90健康體檢者10630.01±2.762.65±1.18

3討論

miRNAs轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)功能與多種疾病的病理生理過程有關(guān)，包括糖尿病。2008年，Bravo-Egana等人[4]通過對(duì)比miR-375在胰島和腺泡組織的不同表達(dá)情況后，得出結(jié)論：miR-7是胰島內(nèi)表達(dá)最豐富的內(nèi)分泌miRNAs。隨后，miR-7參與調(diào)控胰島β細(xì)胞分化發(fā)育，與血糖平衡調(diào)節(jié)有關(guān)的研究陸續(xù)被報(bào)道[5,6]。因此，miR-7有成為診斷糖尿病的新生物學(xué)標(biāo)志物的潛質(zhì)。

要將miRNAs作為疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，需要建立標(biāo)準(zhǔn)且規(guī)范的提取方法和檢測(cè)方法。近年來，miRNAs的檢測(cè)技術(shù)得到了快速發(fā)展。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的miRNAs，克隆測(cè)序是首選的鑒定方法[7]。Northernblot是驗(yàn)證和確認(rèn)miRNAs的經(jīng)典方法，常用來評(píng)價(jià)其它的miRNAs檢測(cè)方法的可靠性，但該方法繁瑣且靈敏度較低，不適用于臨床樣本的高通量檢測(cè)[8]?；蛐酒夹g(shù)可以實(shí)現(xiàn)快速、高通量檢測(cè)[9]，但結(jié)果重復(fù)性差、準(zhǔn)確度低，常用作初篩。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度高、特異性好、操作流程簡(jiǎn)單、設(shè)備和試劑要求相對(duì)較低，因此便于普通臨床實(shí)驗(yàn)室開展。

本研究采用poly(A)聚合酶加尾逆轉(zhuǎn)錄和SYBRGreenI熒光染料標(biāo)記技術(shù)，建立了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清中miR-7的表達(dá)水平。熔解曲線呈特異性單峰，擴(kuò)增曲線呈典型S型，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，也可見明亮、清晰的條帶，且與預(yù)期大小基本一致，證明擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性較好。以人工合成的C.elegans-miR-39miRNA模擬物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，為絕對(duì)定量法，這與目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用較多的相對(duì)定量法[10,11]不同。標(biāo)準(zhǔn)品CT值與其濃度在103copies/uL至106copies/uL的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r2=0.995)，反映該方法能準(zhǔn)確地定量檢測(cè)血清中miR-7的表達(dá)水平。通過批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分析可見：批內(nèi)CV為3.58%，批間CV為5.29%，表明該檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性。由此可見，所建立的檢測(cè)方法可用于臨床上檢測(cè)血清中miR-7的表達(dá)水平。通過分析定量檢測(cè)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)：118例糖尿病患者血清中miR-7的表達(dá)水平明顯高于106例健康體檢者(P=0.015)，這一結(jié)果與之前的文獻(xiàn)報(bào)道[5,6]吻合。

綜上所述，本研究建立的ploy(A)聚合酶加尾的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-7是一種簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好的方法，適合臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛開展，為miR-7在糖尿病中臨床應(yīng)用價(jià)值的深入研究打下了基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目：江蘇省鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(YK20130103)

*通訊作者

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0959-04

中圖分類號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：陳鑫，31歲，碩士，主管檢驗(yàn)技師，主要從事免疫學(xué)及分子生物學(xué)方面的研究。

(收稿日期：2014-09-17)

Establishmentofareal-timefluorescencequantitativePCRmethodfordetectingmiR-7inserumanditsclinicalprimaryapplication

CHEN Xin,HAN Shuang,ZANG Su-gang,et al.

(Department of Clinical Laboratory,Dong-tai Hospital Affiliated Nantong University,Jiangsu Dongtai 224200,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method of SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)by poly(A)polymerase tailing for the determination of miR-7 in serum,and apply it primarily.MethodsTotal RNA was extracted from serum by Trizol reagent.miR-7 was reverse transcripted into cDNA by tailing poly(A)polymerase,and then the cDNA was amplified and detected by using SYBR Green I real-time FQ-PCR.Generate a standard curve of a dilution series of C.elegans-miR-39 mimic,and detect the expression level of miR-7 in serum quantitatively.ResultsThe method can quantitatively detect the expression level of miR-7 in serum.The melting curve showed a single peak,the PCR products was specific,a good linear relationship in the range of 103copies/uL to 106copies/uL (r2=0.995),and the detection was repeatable.The expression level of miR-7 in diabetic patients was significantly higher than those in healthy subjects (P<0.05).ConclusionThe method of SYBR Green I FQ-PCR by poly(A)polymerase tailing can detect the expression level of miR-7 sensitively and specifically in serum.It lays a methodological foundation for further study on clinical application.

Key words:SYBR Green I real-time fluorescence quantitative PCR；miR-7；diabetes mellitus