李占東，李　皓，朱可彤，包曉華，李　琳，劉飛舟，龔秀玲，楊海玲

(1．吉林工程技術(shù)師范學(xué)院 食品工程學(xué)院，吉林 長春130052；2.中國人民解放軍208醫(yī)院，吉林 長春130062；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；4.長春長生生物科技股份有限公司，吉林 長春130103；5.上海紫江企業(yè)集團(tuán)股份有限公司長春分公司，吉林 長春130033)

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人激活素受體結(jié)合蛋白2與結(jié)腸癌相關(guān)性研究

李占東1，李皓1，朱可彤1，包曉華2，李琳3，劉飛舟4，龔秀玲5，楊海玲3

(1．吉林工程技術(shù)師范學(xué)院 食品工程學(xué)院，吉林 長春130052；2.中國人民解放軍208醫(yī)院，吉林 長春130062；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；4.長春長生生物科技股份有限公司，吉林 長春130103；5.上海紫江企業(yè)集團(tuán)股份有限公司長春分公司，吉林 長春130033)

激活素是胞外信號(hào)蛋白TGF-超家族的成員。它具有多種調(diào)控功能，如細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡，代謝的動(dòng)態(tài)平衡，免疫反應(yīng)，創(chuàng)傷修復(fù)及各種內(nèi)分泌功能[1,2]。激活素誘導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)分子Smad蛋白磷酸化，Smad蛋白包括Ⅰ型和Ⅱ型受體。以往的研究表明，hARIP2可以通過與激活素Ⅱ型受體(ActRIIs)結(jié)合減弱激活素信號(hào)[3]。但是，hARIP2在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)分布尚不清楚。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，hARIP2能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增值，hARIP2的表達(dá)量隨著結(jié)腸腫瘤病理分級(jí)的升高而增強(qiáng)。而且，hARIP2的表達(dá)量與結(jié)腸癌腫瘤的體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，hARIP2可能是一種結(jié)腸腫瘤中負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

HCT8細(xì)胞、pcDNA3及構(gòu)建好的pcDNA3-FLAG-hARIP2質(zhì)粒為本課題組保存，隨機(jī)收集(2014年)吉林大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)系I級(jí)結(jié)腸癌組織40例，Ⅱ級(jí)結(jié)腸癌組織28例，Ⅲ級(jí)結(jié)腸癌組織10例。所有病理組織均為首次診斷病例，未進(jìn)行放療、化療及生物治療等。

1.2抗體制備

合成hARIP2羧基端 50個(gè)氨基酸長度的小肽，將合成的小肽免疫新西蘭大白兔，制備抗hARIP2多克隆抗體。通過瓊脂糖凝膠蛋白A(Amersham Biosciences公司)對(duì)特異性抗血清進(jìn)行純化，并用于免疫組化分析。anti-GAPDH抗體購于Abcam公司(英國)。

1.3免疫印跡分析

將pcDNA3及構(gòu)建好的pcDNA3-FLAG-hARIP2質(zhì)粒載體用脂質(zhì)體2000細(xì)胞試劑(Invitrogen公司，美國)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT8細(xì)胞。轉(zhuǎn)染兩天后，HCT8細(xì)胞在PBS溶液中洗滌三次，然后再放到裂解液中裂解(50 mM Tris- HCl(pH=7.5)，150 mM 氯化鈉，1 mM 氟化鈉，1%NP-40，1 mMPMSF，2 μg/ml 亮肽素，和2 μg/ml 抑肽酶)。離心分離裂解液，用考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)測定試劑(上海生工)測定每種上清液的蛋白質(zhì)。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)到PVDF膜上。膜用抗-GAPDH和抗-hARIP2抗體孵育，再將孵育后的膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育。用ECL (Piece Biotechnology公司,美國)化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.4細(xì)胞增殖分析

HCT8細(xì)胞被分別轉(zhuǎn)染pcDNA3(對(duì)照組)，pcDNA3-FLAG-hARIP2質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞被接種到96孔板中，接種密度為1×104每孔，在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中分別培養(yǎng)。24、48、72和96 h。制備20 μl MTT儲(chǔ)備溶液(5 mg/ml溶于 PBS,Sigma)，然后將其加入到各孔中，并且進(jìn)一步將板孵育4 h。孵育后，向每孔加入150 μl DMSO中，劇烈混合均勻，在37℃下孵育15 min后在570 nm處測定吸光度。

1.5hARIP2免疫組織化學(xué)染色

石蠟包埋結(jié)腸癌組織樣本塊進(jìn)行切片，轉(zhuǎn)到聚L-賴氨酸包被的載玻片上。脫石蠟后，在10 mM檸檬酸鹽緩沖液的抗原表位測定非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。切片在5%正常兔血清的PBS (pH 7.4)中孵育20 min。用PBS洗滌，切片組織加入抗hARIP2抗體，1∶500倍稀釋，稀釋液為的1% PBS溶液，4℃孵育12 h。用PBS充分洗滌后，加入生物素標(biāo)記的二抗，并在室溫孵育20 min。PBS洗滌，切片與過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物在室溫下孵育20 min。用DAB顯色液顯色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的體外實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每個(gè)結(jié)果是3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。由t檢驗(yàn)分析組之間的差異，P值小于0.05被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性。

2結(jié)果

2.1HCT8細(xì)胞中hARIP2過表達(dá)的免疫印跡分析

為確定hARIP2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用，用轉(zhuǎn)染pcDNA3-FLAG-hARIP2載體上調(diào)其表達(dá)。在HCT8細(xì)胞中，hARIP2的表達(dá)量增加。在其他結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中也獲得相似的結(jié)果(結(jié)果未示出)。這些結(jié)果表明，pcDNA3-FLAG-hARIP2載體使hARIP2在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)量上調(diào)；以合成小肽做為抗原制備的hARIP2多克隆抗體能夠識(shí)別結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)天然hARIP2抗原決定簇(圖1)。

圖1　HCT8細(xì)胞中hARIP2過表達(dá)的免疫印跡分析

pcDNA3-FLAG-hARIP2載體及陰性對(duì)照組(control )分別被轉(zhuǎn)染HCT8細(xì)胞，每個(gè)樣品都添加等量細(xì)胞裂解液，抗體選用抗GAPDH抗體和抗hARIP2抗體，通過免疫印跡進(jìn)行分析。

2.2hARIP2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

用pcDNA3及pcDNA3-FLAG-hARIP2載體轉(zhuǎn)染HCT8細(xì)胞，研究hARIP2在人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞中的增殖的作用。采用MTT法測定轉(zhuǎn)染有對(duì)照及hARIP2的HCT8細(xì)胞在體外的增殖。MTT實(shí)驗(yàn)均在24、48、72和96 h的條件下進(jìn)行，在570 nm處測定吸光度，每個(gè)數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞增殖曲線。細(xì)胞增殖活性如圖2所示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。MTT法檢測的結(jié)果表明，過表達(dá)hARIP2增加細(xì)胞增殖。在其他的腫瘤細(xì)胞中也得到同樣的結(jié)果。這些結(jié)果表明是hARIP2促進(jìn)了人類結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖2　體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hARIP2對(duì)HCT8 細(xì)胞增殖的作用

2.3hARIP2在不同病理分級(jí)的結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，在40例Ⅰ級(jí)結(jié)腸癌組織(圖3B)中為中強(qiáng)度至低強(qiáng)度染色；28例Ⅱ級(jí)結(jié)腸癌組織以及10例Ⅲ級(jí)結(jié)腸癌組織(圖3C、3D)在結(jié)腸癌中檢測到是高強(qiáng)度染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著結(jié)腸癌組織的病理分級(jí)的增高，hARIP2的表達(dá)量也相應(yīng)增高。

圖3免疫組化分析hARIP2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況。組織被染成棕黃色為陽性免疫反應(yīng)，細(xì)胞核呈藍(lán)色，A.陰性對(duì)照(未加一抗)。B.病理Ⅰ級(jí)組織。C.病理Ⅱ級(jí)組織。D.病理Ⅲ級(jí)組織。放大倍數(shù)是×20。

2.4hARIP2免疫強(qiáng)度的分析

統(tǒng)計(jì)表明，hARIP2在病理分級(jí)程度高的結(jié)腸癌組織(89.3%Ⅱ級(jí)結(jié)腸癌組織；100%Ⅲ級(jí)結(jié)腸癌組織；表1)中表達(dá)更強(qiáng)，比它在病理分級(jí)程度低的結(jié)腸癌組織(62.5%Ⅰ級(jí)結(jié)腸癌組織，表1)中表達(dá)更強(qiáng)。此外，我們的結(jié)果表明，hARIP2的表達(dá)與在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(表2)，結(jié)腸癌腫瘤大小(表3)是呈正相關(guān)的。

表1　hARIP2染色強(qiáng)度與結(jié)腸癌組織病理分級(jí)的關(guān)系

表2　hARIP2染色強(qiáng)度與結(jié)腸癌組織淋巴結(jié)狀態(tài)的關(guān)系

表3　hARIP2染色強(qiáng)度與結(jié)腸癌組織體積大小的關(guān)系

3討論

結(jié)腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，在我國近20年以來其發(fā)病率逐年升高，以大城市更為明顯，且出現(xiàn)結(jié)腸癌多于直腸癌的趨勢，雖然最近診斷和治療手段的進(jìn)展挽救了許多早期腫瘤患者的生命，但晚期及轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍不理想。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多步驟、多階段及多基因方面研究結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展尤為重要。

激活素屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員中的一種多功能生長和分化因子，能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。激活素通過其I型和Ⅱ型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體介導(dǎo)產(chǎn)生不同的生物學(xué)功能。激活素直接與其Ⅱ型受體結(jié)合，導(dǎo)致募集、磷酸化I型受使其激活，一旦被激活，Ⅰ型受體結(jié)合并磷酸化Smad蛋白。這些轉(zhuǎn)錄后的Smad蛋白，將細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。到目前為止，已知的ActRIIs的功能僅限于與配體結(jié)合，募集Ⅰ型受體和轉(zhuǎn)磷酸化作用。激活素Ⅱ型受體包括兩種亞型，即激活素Ⅱ型受體A和激活素Ⅱ型受體B，每一個(gè)亞型都由單獨(dú)的基因編碼。此外，還有兩個(gè)ActRIIA的剪接突變體及五個(gè)ActRIIB的剪接突變體已被發(fā)現(xiàn)[5-7]。據(jù)推測，ActRIIs在激活素信號(hào)中起著重要的作用。

已有研究表明，激活素能夠抑制多種類型腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。且激活素與結(jié)腸癌密切相關(guān)。激活素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成分已被確定為腫瘤抑制基因[9]。激活素信號(hào)成分的缺失或減少，使某些腫瘤變得更具有侵襲性，此外，激活素已被報(bào)道通過激活Smad蛋白抑制腫瘤細(xì)胞的生長。由于hARIP2可以增強(qiáng)ActRII的內(nèi)吞作用，并通過Ral/RalBP1-depending的通路降低ActRIIA在細(xì)胞膜上的表達(dá)，并具有抑制激活素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。因此，可以認(rèn)為hARIP2可能參與結(jié)腸癌的功能調(diào)節(jié)。在本研究中，我們通過對(duì)不同結(jié)腸癌病理階段進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，hARIP2表達(dá)水平在不同病理分級(jí)的結(jié)腸癌組織中呈正相關(guān)，說明hARIP2與腫瘤的分化有著密切的聯(lián)系。hARIP2對(duì)結(jié)腸腫瘤細(xì)胞增值的促進(jìn)作用及hARIP2表達(dá)量與腫瘤體積及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，說明hARIP2能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，我們推測hARIP2在結(jié)腸腫瘤形成過程中起著一定的作用。

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基金項(xiàng)目：吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助(2012050)；吉林省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20130101156JC)

文章編號(hào)：1007-4287(2016)06-0893-03

作者簡介：李占東(1979-)，男，講師，博士，研究方向?yàn)槟[瘤發(fā)生機(jī)制研究。

(收稿日期：2015-11-19)