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        白介素-6反式信號(hào)通路抑制劑改善大鼠急性胰腺炎肺損傷

        2016-07-22 01:30:22張衛(wèi)中辛棟軼張丹婷廖南生
        中華胰腺病雜志 2016年3期
        關(guān)鍵詞:組肺通透性反式

        張衛(wèi)中 辛棟軼 張丹婷 廖南生

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        白介素-6反式信號(hào)通路抑制劑改善大鼠急性胰腺炎肺損傷

        張衛(wèi)中辛棟軼張丹婷廖南生

        318020浙江臺(tái)州,臺(tái)州市第一人民醫(yī)院普外科

        急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥,約20%~30%患者可發(fā)展成為以胰腺局部壞死和臟器功能衰竭為特征的重癥急性胰腺炎(SAP)。急性肺損傷(acute pancreatitis associated acute lung injury,APALI)是其最常見的并發(fā)癥,患者可出現(xiàn)低氧血癥、急性呼吸窘迫綜合征等臨床表現(xiàn)[1]。研究表明,白細(xì)胞介素6(IL-6)在APALI的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。IL-6根據(jù)其跨膜信號(hào)傳遞形式不同在炎癥中的作用也不同,其信號(hào)傳遞通路主要分為兩種,即經(jīng)典信號(hào)通路和反式信號(hào)通路[2]。目前眾多研究集中在經(jīng)典信號(hào)通路,很少涉及到IL-6反式信號(hào)通路。本研究采用人工合成的特異性抑制劑(sgp130Fc)阻斷該信號(hào)通路,闡明其在大鼠APALI發(fā)病中的保護(hù)作用。

        一、材料及方法

        1.動(dòng)物模型建立及分組:健康SD雄性大鼠72只,體重(247±35)g,由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)表法將大鼠分為假手術(shù)組、ANP組、干預(yù)組,每組24只。大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)模型按照本課題組建立的經(jīng)膽胰管逆行注射5%牛黃膽酸鈉(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備[3]。假手術(shù)組注射等容積生理鹽水;干預(yù)組大鼠在制模前30 min腹腔注射sgp130Fc(江蘇弗泰生物科技提供)100 μg/kg體重(1 mg凍干粉溶于10 ml蒸餾水)。于造模后3、12、24 h分批處死大鼠,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只。

        2.肺組織髓過氧化物酶(MPO)檢測:取肺組織0.1 g,置冰生理鹽水中洗凈后制備組織勻漿,4℃ 2 300 r/min離心30 min,取上清液0.1 ml加0.167 mol/L鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸化物以及0.0005%過氧化氫混合液2.9 ml,在恒溫紫外分光光度計(jì)460 nm處連續(xù)記錄A460值1 min,以A460值·g-1·min-1表示MPO的活性[4]。

        3.肺組織含水量測定:取相同部位的肺組織100 mg,置70℃電熱干燥箱內(nèi)烘烤24 h,稱干重,以肺組織濕/干比重[(肺濕重-肺干重)/肺干重]表示肺組織含水量。

        4.肺微血管通透性檢測:造模后12 h通過左股靜脈注射FITC-標(biāo)記的血清蛋白5.0 mg/kg體重(Sigma Chemical公司),12 h后抽血,離心分離血清,-80℃保存;同時(shí)氣管內(nèi)插入18號(hào)血管導(dǎo)管,用4 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗肺泡腔,收集肺泡灌洗液(Balf),重復(fù)3次。用熒光分光計(jì)分別測量血清和Balf的FITC熒光,激發(fā)光494 nm,發(fā)射光520 nm。以Balf與血清FITC的熒光率比值表示肺微血管滲透性。

        5.大鼠肺組織病理學(xué)檢測:取剩余肺組織置液氮中保存。融化后常規(guī)行病理學(xué)檢查。參考Kusske等[5]和Mayer等[6]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺臟病理評(píng)分。

        二、結(jié)果

        1.肺組織MPO活性變化:假手術(shù)組大鼠肺組織MOP活性為(0.56±0.04)A460值·g-1·min-1;ANP 3、12、24 h組分別為(2.21±0.52)、(4.71±0.32)、(7.84±0.11)A460值·g-1·min-1,均顯著高于假手術(shù)組,且隨時(shí)間延長而增加;干預(yù)3、12、24 h組分別為(1.86±0.17)、(2.54±0.27)、(5.74±0.19)A460值·g-1·min-1,干預(yù)12、24 h組肺MOP活性均顯著低于ANP同時(shí)間點(diǎn)組,但仍顯著高于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

        2. 肺組織含水量的變化:假手術(shù)組大鼠肺含水量為1.57±0.14,ANP 3、12、24 h組分別為3.79±0.21、3.93±0.14、4.11±0.07,均顯著高于假手術(shù)組,且隨時(shí)間延長而增加;干預(yù)3、12、24 h組大鼠肺組織含水量分別為3.47±0.15、3.19±0.11、3.75±0.14,干預(yù)組12、24 h組肺含水量均顯著低于ANP同時(shí)間點(diǎn)組,但仍顯著高于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

        3.肺微血管通透性變化:假手術(shù)組、ANP 24 h組、干預(yù)24 h組肺微血管通透性分別為9.48±0.26、20.89±0.34、11.66±0.13,ANP組肺微血管通透性顯著高于假手術(shù)組,干預(yù)組較ANP組顯著減輕,但仍顯著高于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

        4.肺組織病理學(xué)改變:假手術(shù)組肺組織無明顯的病理改變;ANP組大鼠肺泡壁明顯增厚、間質(zhì)充血、白細(xì)胞浸潤,隨時(shí)間延長而加重;干預(yù)組大鼠肺組織的病理改變明顯減輕(圖1)。假手術(shù)組,ANP 3、12、24 h組,干預(yù)3、12、24 h組大鼠肺組織病理評(píng)分分別為(0.55±0.52)、(2.25±0.47)、(5.26±0.84)、(5.31±0.69)、(2.14±0.2)、(3.36±0.59)、(3.28±0.71)分,ANP組、干預(yù)組均顯著高于假手術(shù)組,干預(yù)12、24 h組又顯著低于ANP同時(shí)間點(diǎn)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。

        圖1假手術(shù)組(1A,HE×100)、ANP組(1B,HE×200)、干預(yù)組(1C,HE×200)肺組織病理改變

        討論IL-6信號(hào)通路有兩種,一是經(jīng)典信號(hào)通路,該通路中IL-6與細(xì)胞膜上的IL-6受體(IL-6R)結(jié)合后經(jīng)受體關(guān)聯(lián)的gpl30向胞內(nèi)傳遞次級(jí)信號(hào),但I(xiàn)L-6R僅僅在肝細(xì)胞、部分上皮細(xì)胞和白細(xì)胞膜上表達(dá)。在反式信號(hào)通路上, IL-6與游離于細(xì)胞外液中的sIL-6R結(jié)合成復(fù)合體,然后再結(jié)合至膜表面的gpl30亞單位,進(jìn)而完成信號(hào)傳遞[7-8]。因?yàn)間p130蛋白幾乎在所有的細(xì)胞中表達(dá),故該信號(hào)通路更加廣泛。

        gpl30為分子量130 000的糖蛋白,共有14個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)。在生理情況下,gpl30不能直接與配基IL-6結(jié)合,當(dāng)IL-6與IL-6R結(jié)合使IL-6R的構(gòu)象發(fā)生變化后迅速與兩個(gè)gpl30分子結(jié)合,形成高親和力的結(jié)合位點(diǎn),而可溶性gp130(sgpl30)可抑制sIL-6R/IL-6復(fù)合物的活性[8]。人工合成的sgpl30為IgG1-Fc融合蛋白的形式(sgp130Fc),具備與自然狀態(tài)下sgp130相同的功能,即特異性抑制IL-6反式信號(hào)通路的發(fā)生而對(duì)經(jīng)典信號(hào)通路無任何抑制作用。

        IL-6在AP患者中明顯升高,且與AP的嚴(yán)重程度密切相關(guān),也是最早發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)與SAP并發(fā)肺損傷有密切關(guān)系的炎性遞質(zhì)[9]。炎癥發(fā)生時(shí),循環(huán)系統(tǒng)必須提供足夠數(shù)量的sIL-6R與IL-6結(jié)合形成復(fù)合體,否則反式信號(hào)通路將無法實(shí)現(xiàn)。本課題組曾報(bào)道[3],ANP大鼠血sIL-6R水平顯著高于假手術(shù)組,說明ANP時(shí)sIL-6R數(shù)量明顯升高,可與IL-6充分結(jié)合介導(dǎo)反式信號(hào)通路。外源性應(yīng)用sgp130Fc與sIL-6R/IL-6復(fù)合體結(jié)合后,導(dǎo)致sIL-6R和IL-6R數(shù)量明顯下降。

        本研究預(yù)先應(yīng)用sgp130干預(yù)ANP大鼠,結(jié)果顯示,干預(yù)后大鼠的肺組織病理學(xué)評(píng)分、MPO活性及微血管通透性均較ANP組明顯改善,推測其是通過抑制IL-6反式信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

        參考文獻(xiàn)

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        [2]Zhang H, Neuh?fer P, Song L, et al. IL-6 trans-signaling promotes pancreatitis-associated lung injury and lethality[J]. J Clin Invest, 2013, 123(3):1019-1031. DOI: 10.1172/JCI64931.

        [3]張衛(wèi)中,張丹婷,辛棟軼,等. 白細(xì)胞介素-6反式信號(hào)通路促進(jìn)急性胰腺炎肺損傷[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2015, 32(11):2895. DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2015.11.092.

        [4]紅山,薛煥洲,潘承恩. p38 MAPK抑制劑對(duì)急性胰腺炎肺損傷肺內(nèi)細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)和肺微血管通透性的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2010, 27(4):471-473. DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2010.04.025.

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        (本文編輯:呂芳萍)

        DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.014

        基金項(xiàng)目:2014年臺(tái)州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(14SF06)

        通信作者:張衛(wèi)中,Email:zhangweizhong11@hotmail.com

        (收稿日期:2015-12-15)

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