許威　陳凱　向曉輝　夏時(shí)海

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·論著·

氧化苦參堿體外抑制胰腺星狀細(xì)胞激活和p38-MAPK mRNA表達(dá)

許威陳凱向曉輝夏時(shí)海

300162天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽胰脾中心(消化二科)

【摘要】目的驗(yàn)證氧化苦參堿(OM)在體外對胰腺星狀細(xì)胞(PSC)激活的抑制作用，探討其作用機(jī)制。方法觀察經(jīng)不同濃度OM干預(yù)后大鼠PSC細(xì)胞株LTC-14在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)激活后的增殖能力，應(yīng)用ELISA法檢測細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)水平，用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測細(xì)胞絲裂原激活蛋白激酶p38(p38-MAPK) mRNA表達(dá)量。結(jié)果對照組及0.1、0.5、1、2、5 g/L OM干預(yù)30 min后再加8 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)組(OM組)細(xì)胞在培養(yǎng)12 h后的細(xì)胞增殖分別為1.51±0.08、1.50±0.07、1.15±0.04、1.15±0.04、1.08±0.06、1.08±0.10，0.5 g/L以上的OM組低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均為0.000)。對照組、TGF-β1組及0.5、1 g/L OM組培養(yǎng)12 h后LTC-14細(xì)胞SOD的水平分別為0.087±0.005、0.073±0.004、0.085±0.010、0.086±0.007，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p38-MAPK mRNA表達(dá)量分別為1.000±0.000、1.979±0.505、0.606±0.111、0.303±0.159，TGF-β1組顯著高于對照組(P=0.002)，兩個(gè)OM組均低于TGF-β1組(P值均為0.000)，但兩個(gè)OM組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.208)。結(jié)論OM體外能夠抑制PSC的激活，其作用機(jī)制可能是通過抑制p38-MAPK mRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】氧化苦參堿；胰腺星狀細(xì)胞；激活；氧化應(yīng)激；p38-MAPK

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81173393)；Tianjin Science and Technology Commission(12JCZDJC25500, 15JCQNJC45600)；Innovative Team of Logistics University of the Chinese People′s Armed Police Forces(WHTD201310)；Seed Fund of Affiliated Hospital of Logistics University of the Chinese People′s Armed Police Forces(FYM201114);Doctor′s Initial Fund of Logistics University of the Chinese People′s Armed Police Forces(WHB201515)

慢性胰腺炎(CP)以胰腺纖維化為主要病理特征，胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell，PSC)的激活是胰腺纖維化的關(guān)鍵過程[1]。有研究證實(shí)，氧化苦參堿(oxymatrine，OM)對肝臟等器官的纖維化有明顯的治療作用并已用于臨床[2]，其作用機(jī)制可能是抑制肝星狀細(xì)胞的增殖。本課題組前期研究證實(shí)，OM能減輕CP大鼠的胰腺纖維化[3-4]，但具體機(jī)制不明。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察OM對PSC激活的影響，探討氧化應(yīng)激和絲裂原激活蛋白激酶p38(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)是否參與該過程。

材料與方法

一、材料及試劑

永生化的大鼠胰腺星狀細(xì)胞株LTC-14由德國Rostock大學(xué)醫(yī)院Jaster教授惠贈[5]。OM、MTT購于 Sigma公司。IMDM培養(yǎng)基購于Hyclone公司。胎牛血清購于Gibco公司。PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自北京全式金公司。超氧化物歧化酶(SOD) ELISA試劑盒購于德國IBL公司。

二、MTT法檢測PSC增殖狀況

LTC-14細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，分別加入4、8、12、16、20 μg/L的TGF-β1，以不加TGF-β1的細(xì)胞為對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)6、12、24 h，加入MTT 5 mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，甩盡培養(yǎng)液，加入150 ml DMSO，震蕩10 min，上酶標(biāo)儀測每孔在570 nm波長處的吸光度值(A570值)，篩選有效誘導(dǎo)PSC增殖的最小TGF-β1干預(yù)濃度及干預(yù)時(shí)長。

同樣取對數(shù)生長期細(xì)胞接種96孔板，分別加入0.1、0.5、1、2、5 g/L OM，以不加OM的細(xì)胞作為對照組，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)30 min后加入上述實(shí)驗(yàn)篩選出的最小TGF-β1干預(yù)濃度培養(yǎng)6、12、24 h，加MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，測各孔A570值，篩選抑制PSC增殖的最佳OM干預(yù)濃度及干預(yù)時(shí)長。

三、ELISA法檢測細(xì)胞SOD水平

按試劑盒說明書要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后加入96孔板，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種96孔板，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)獲得的最佳OM干預(yù)濃度及干預(yù)時(shí)長處理30 min后用最小濃度TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞(OM組)，同時(shí)設(shè)單加TGF-β1的TGF-β1組及不加任何處理的對照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。封板膜后37℃溫育30 min，棄培養(yǎng)液，用試劑盒里包含的洗滌液重復(fù)洗滌5次，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，37℃溫育30 min，洗滌5次，每孔先后加入顯色劑A和B各50 μl，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min，加終止液50 μl終止反應(yīng)，上酶標(biāo)儀測各孔A450值。

四、實(shí)時(shí)PCR法檢測細(xì)胞p38-MAPK mRNA表達(dá)

查詢相關(guān)文獻(xiàn)和GenBank，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)p38-MAPK引物，正義序列5′-CAGGAGCTGAACAAGACCGT-3′，反義序列5′-CCTGTAGGTCCTTTTGGCGT-3′，產(chǎn)物200 bp；內(nèi)參β-actin正義序列5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′，反義序列5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′，產(chǎn)物200 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。采用Trazol抽提各組細(xì)胞總RNA，定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說明書步驟應(yīng)用 SYBR染料法在ABI7500實(shí)時(shí)PCR儀上擴(kuò)增，繪制溶解和擴(kuò)增曲線。通過儀器自帶軟件獲取Ct值，按公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、PSC增殖的變化

誘導(dǎo)PSC增殖的最小TGF-β1濃度為8 μg/L，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h(表1)。

在OM干預(yù)30 min后以8 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)LTC-14細(xì)胞。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)各組細(xì)胞增殖水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.739)；誘導(dǎo)時(shí)間為12、24 h、且OM濃度在0.5 g/L以上時(shí)細(xì)胞的增殖均低于對照組和0.1 g/L OM組(P值分別為0.000、0.001)，而0.5 g/L以上的各OM組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1　不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)后PSC的A570值

注：與對照組比較，aP<0.01；與4 g/L組比較，bP<0.01

表2　不同濃度OM干預(yù)后PSC的A450值

注：與對照組比較，aP<0.01；與0.1 g/L組比較，bP<0.01

二、細(xì)胞SOD水平及變化

對照組、TGF-β1組及0.5、1 g/L OM組干預(yù)12 h后LTC-14細(xì)胞SOD的A450值分別為0.087±0.005、0.073±0.004、0.085±0.010、0.086±0.007，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095)。

三、細(xì)胞p38-MAPK mRNA表達(dá)的變化

對照組、TGF-β1組及0.5、1 g/L OM組干預(yù)12 h后LTC-14細(xì)胞p38-MAPK mRNA表達(dá)量分別為1.000±0.000、1.979±0.505、0.606±0.111、0.303±0.159。TGF-β1組顯著高于對照組(P=0.002)，兩個(gè)OM干預(yù)組均顯著低于TGF-β1組(P=0.000)，但兩個(gè)OM干預(yù)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.208)。

討論

苦參系藥用豆科槐屬植物苦參的干燥根，性寒味苦，始載于我國最早的藥學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》。隨著分離提取技術(shù)的進(jìn)步,發(fā)現(xiàn)在苦參、苦豆子、廣豆根中存在同一類以O(shè)M為代表的生物堿。OM化學(xué)分子式為C15H24N2O2，分子質(zhì)量為282，是苦參型生物堿的主要活性成分，有多方面的藥理作用，如抗菌、抗炎、抗風(fēng)濕、抗腫瘤、抗過敏、免疫及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)作用等[6]。近年大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究結(jié)果表明OM具有明顯的抗器官纖維化作用，如抗肝纖維化、抗皮膚纖維化和抗腎間質(zhì)纖維化等，其中以抗肝纖維化研究較為深入。本課題組前期研究也證實(shí)OM具有抗胰腺纖維化的作用[3-4]，結(jié)合近年研究報(bào)道的PSC激活在胰腺纖維化中的重要角色，故推測OM很可能是通過抑制PSC的激活以實(shí)現(xiàn)抗胰腺纖維化的作用。PSC激活的重要標(biāo)志就是增殖能力明顯增強(qiáng)，本研究結(jié)果顯示，0.5 g/L以上的OM干預(yù)PSC 12 h以上能夠顯著抑制TGF-β1所激活的PSC的增殖，表明OM體外能夠抑制PSC激活。

氧化應(yīng)激是PSC激活的重要機(jī)制。在慢性酒精性胰腺炎纖維化區(qū)可見脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，并觀察到激活的PSC。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)乙醇能夠激活PSC，其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān)[7]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用乙醇后胰腺細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激是胰腺損傷的早期反應(yīng)。OM有可能通過降低氧化應(yīng)激水平來抑制PSC激活。本研究結(jié)果顯示，OM 干預(yù)后LTC-14細(xì)胞SOD水平未發(fā)生顯著變化，說明OM抑制PSC激活的作用不是通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

近年對PSC激活的分子機(jī)制進(jìn)行了一些研究。MAPKs是一類細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的具有絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶，有4種MAPKs，其中ERK1/ERK2、JNK1/JNK2、p38-MAPK最具代表性。McCarroll等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇和乙醛能夠增加PSC提取液中ERK1/2、JNK、p38-MAPK的表達(dá)，用這3種激酶的特異性抑制劑干預(yù)后只有p38-MAPK的特異性抑制劑能抑制PSC的α-SMA表達(dá)，提示p38-MAPK途徑介導(dǎo)了乙醇和乙醛誘導(dǎo)的PSC激活。Masamune等[9]研究也有類似結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1刺激PSC后p38-MAPK mRNA水平較對照組增高，OM干預(yù)則降低p38-MAPK mRNA水平，提示OM可能通過抑制p38-MAPK的轉(zhuǎn)錄來抑制PSC的激活。

(志謝感謝香港浸會大學(xué)卞兆祥教授和天津中醫(yī)藥大學(xué)商洪才教授對本工作的幫助！)

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(本文編輯：呂芳萍)

Oxymatrine suppressed the activation of pancreatic stellate cells and p38-MAPK mRNA expression in vitro

XuWei,ChenKai,XiangXiaohui,XiaShihai.

SecondDepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityoftheChinesePeople′sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China

【Abstract】ObjectiveTo clarify whether oxymatrine(OM) could suppress the activation of pancreatic stellate cells (PSC) and explore the potential molecular mechanism. MethodsThe proliferation of PSC line LTC 14 being activated by TGF-β1 with OM treatment at different concentrations (OM group) was measured. SOD level was determined by ELISA and p38-MAPK mRNA was determined by real-time PCR. ResultsThe proliferation of PSC in the control group, 0.1, 0.5, 1, 2, 5 g/L OM group was (1.51±0.08), (1.50±0.07), (1.15±0.04), (1.15±0.04), (1.08±0.06), and (1.08±0.10), respectively. The level of the control group was lower than the groups where the concentration of OM reached or exceeded 0.5mg/ml (all P=0.000). SOD level of LTC 14 cells in the control group, TGF-β1 group, 0.5 and 1 g/L OM group was (0.087±0.005), (0.073± 0.004), (0.085±0.010), and (0.086±0.007), respectively. No statistically significant difference existed among the groups (P=0.095). The p38-MAPK mRNA expression of PSC in the control group, TGF-β1 group, 0.5, and 1 g/L OM group was (1.000±0.000), (1.979±0.505), (0.606±0.111), and (0.303±0.159), respectively. The p38-MAPK mRNA level of TGF-β1 group was higher than that of the control group (P=0.002), and that of 0.5 mg/ml OM group and 1 mg/ml OM group was lower that of TGF-β1 group (P=0.000), while no statistical difference was found between 0.5 mg/ml OM group and 1 mg/ml OM group. ConclusionsOM could suppress the activation of PSC in vitro and the suppression of p38-MAPK mRNA expression may be involved.

【Key words】Oxymatrine;Pancreatic stellate cell;Activation;p38-MAPK

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.010

通信作者：夏時(shí)海，Email：xshhcx@sina.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81173393)；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(12JCZDJC25500、15JCQNJC45600)；武警后勤學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金項(xiàng)目(WHTD201310)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院科研種子基金面上項(xiàng)目(FYM201114)；武警后勤學(xué)院博士啟動金項(xiàng)目(WHB201515)

Corresponding author:Xia Shihai, Email: xshhcx@sina.com

(收稿日期：2015-08-11)