劉建化　馬冬　陳少杰　練國(guó)達(dá)　李佳佳　黃開紅

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·論著·

胎盤生長(zhǎng)因子基因沉默對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞遷移和侵襲的影響

劉建化馬冬陳少杰練國(guó)達(dá)李佳佳黃開紅

510180廣州，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省人民醫(yī)院胃腸腫瘤內(nèi)科

【摘要】目的探討胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)基因沉默對(duì)人胰腺癌PANC1細(xì)胞遷移、侵襲能力及化療藥物耐藥性的影響。方法設(shè)計(jì)并合成3個(gè)靶向PIGF的siRNA(siRNA-PIGF)，以非特異性的siRNA(siRNA-NC)作為轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照。采用脂質(zhì)體法將siRNA轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)RT-PCR和ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞PIGF mRNA及蛋白表達(dá)抑制率；MTT法檢測(cè)化療藥物處理對(duì)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率；Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果轉(zhuǎn)染3個(gè)siRNA-PIGF的PANC1細(xì)胞PIGF mRNA表達(dá)抑制率分別為(64.38±8.92)%、(70.48±7.72)%、(81.25±6.02)%，以轉(zhuǎn)染siRNA-PIGF-3的基因沉默效應(yīng)最佳。轉(zhuǎn)染24 h后，siRNA-PIGF組細(xì)胞PIGF mRNA表達(dá)量較siRNA-NC組下降(63.72±8.20)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(75.07±8.25)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；轉(zhuǎn)染48 h后，培養(yǎng)上清液PIGF蛋白含量較siRNA-NC組下降(42.92±1.34)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(46.25±3.64)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)，而未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 ng/L吉西他濱處理后，siRNA-PIGF組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著高于siRNA-NC組及未轉(zhuǎn)染組[(44.35±5.05)%比(34.29±3.60)%、(31.01±1.08)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而5-氟尿嘧啶或阿霉素處理后3組的生長(zhǎng)抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，siRNA-PIGF組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為siRNA-NC組的38.1%、28.2%，為未轉(zhuǎn)染組的40.8%、36.2%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。結(jié)論P(yáng)IGF 基因沉默能顯著抑制胰腺癌PANC1細(xì)胞的遷移與侵襲能力，能增強(qiáng)對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；RNA，小分子干擾；胎盤生長(zhǎng)因子；腫瘤浸潤(rùn)

Fund program: Science and Technology Commission Foundation of Guangdong Province(2013B021800233)

胰腺癌確診時(shí)多屬晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，且對(duì)化療不敏感，預(yù)后差[1-2]。影響胰腺癌預(yù)后的諸多因素中，除了理化環(huán)境、診治方法、分子生物學(xué)特征等，惡性腫瘤對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)和器官的轉(zhuǎn)移與預(yù)后也密切相關(guān)[3-4]。因此，深入探討胰腺癌侵襲與遷移的分子機(jī)制對(duì)提高胰腺癌療效具有重要理論意義和臨床指導(dǎo)價(jià)值。胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PIGF)是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族重要成員，作為調(diào)控血管生長(zhǎng)的重要因子，能促進(jìn)新生血管形成，同時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞也有趨化、聚集作用[5]。它在多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、血管生成和免疫逃避中扮演重要的角色[6]，并與腫瘤放化療敏感性降低有關(guān)，是抗腫瘤治療的靶點(diǎn)之一。有研究表明[7]，下調(diào)PIGF表達(dá)能抑制腫瘤生長(zhǎng)及促進(jìn)腫瘤血管正?；Ｄ壳瓣P(guān)于PlGF 在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用報(bào)道較少，本研究觀察PIGF基因沉默后對(duì)人胰腺癌PANC1細(xì)胞、遷移、侵襲、耐藥性等生物學(xué)行為的影響。

材料和方法

一、材料與試劑

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1(K-ras突變型)購(gòu)自上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液、Trizol、Lipofectamin2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；抗人PIGF ELISA試劑盒、Matrigel基底膜購(gòu)自美國(guó)BD公司；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑(RNasin)購(gòu)自Promega公司；Taq酶、dNTP、SYBR Green購(gòu)自TaKaRa公司；PCR引物采用Primer Priemer 6.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程公司合成；MTT購(gòu)自Sigma公司；8μm微孔Transwell小室購(gòu)自Corning公司。

二、siRNA設(shè)計(jì)、合成

根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則和PIGF基因序列，設(shè)計(jì)3對(duì)靶向PIGF基因的特異性siRNA序列。siRNA-PIGF-1序列為5′-AATTCAAAAAACGAACGTACTTGCAGATGTCTCTTGAACATCTGCAAGTACGT-TCG-3′；siRNA-PIGF-2序列為5′-AATTCAAAAAGATCCGCAGACGTGTAAATTCTCTTGAAATTTACA-CGTCTGCGGAT-3′；siRNA-PIGF-3序列為5′-AATTCAAAAAGGCAGAATCATCACGAAGTTCTCTTGAA-ACTTCGTGATGATTCTGC-3′。同時(shí)設(shè)計(jì)不針對(duì)任何靶基因的非特異性陰性對(duì)照siRNA(siRNA-NC)，序列為5′-UUCUCACCGCGAAUGUCGUTT-3′。siRNA由上海吉?jiǎng)P基因公司采用化學(xué)合成法合成。

三、siRNA轉(zhuǎn)染

PANC1細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到6孔板，每孔6.0×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)到第2天待細(xì)胞60%融合時(shí)應(yīng)用脂質(zhì)體方法將各siRNA分別轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，按Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書操作，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后4 h更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

四、實(shí)時(shí)RT-PCR

取上述轉(zhuǎn)染24 h的各組PANC1細(xì)胞，采用Trizol提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度和純度后，以總RNA為模板，采用SYBR Green染料法在羅氏熒光PCR儀進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增。PIGF正義引物5′-ACGTGGAGCTGACGTTCTCT-3′，反義引物5′-CAGCAGGAGTCAC TGAAGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物248 bp；以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH正義引物5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，反義引物5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物150 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 1 min、55℃ 35 s，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢進(jìn)行熔解曲線分析，PIGF mRNA相對(duì)表達(dá)量用公式2-△△Ct計(jì)算， PIGF mRNA表達(dá)抑制率=(對(duì)照組PIGF mRNA表達(dá)量-轉(zhuǎn)染組PIGF mRNA表達(dá)量)/ 對(duì)照組PIGF mRNA表達(dá)量×100%。篩選PIGF基因沉默效應(yīng)最佳的siRNA-PIGF。

取沉默效應(yīng)最佳的siRNA-PIGF、siRNA-NC轉(zhuǎn)染6、24 h后的PANC1細(xì)胞，另取未轉(zhuǎn)染的PANC1細(xì)胞作為對(duì)照組，檢測(cè)各組細(xì)胞的PIGF mRNA表達(dá)，方法同上。以對(duì)照組的mRNA表達(dá)量為1，計(jì)算轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的mRNA表達(dá)抑制率。

五、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

取上述3組培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)上清液，加入包被特異性抗體的96孔板，每孔100 μl，設(shè)4個(gè)復(fù)孔。應(yīng)用ELASA法檢測(cè)上清液中PIGF蛋白含量，按試劑盒說(shuō)明書操作。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式計(jì)算待測(cè)標(biāo)本的PIGF蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

六、MTT法

取上述3組培養(yǎng)24 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入0.03、0.3、3 ng/L的吉西他濱(Gem)，0.3、3、30 ng/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)，0.04、0.4、4 ng/L的阿霉素(ADM)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)到時(shí)間點(diǎn)后，每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，上酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度值(A570值)，以未加藥物處理細(xì)胞作為對(duì)照組，以空白孔調(diào)零。藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的相對(duì)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A570值/對(duì)照組A570值)×100%。

七、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，PBS清洗后重懸于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。取100 μl(2×105個(gè))細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加500 μl 20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃平衡1 h后置 37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉棒擦凈未穿透濾膜的細(xì)胞，PBS沖洗后甲醛固定，Giemsa染色，顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)400倍視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

八、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel按50 μl/cm2比例加到Transwell小室聚碳脂膜的上表面，37℃孵箱過(guò)夜待其凝固，其他步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、PIGF基因沉默效應(yīng)的篩選

轉(zhuǎn)染3個(gè)siRNA-PIGF的PANC1細(xì)胞PIGF mRNA表達(dá)抑制率分別為(64.38±8.92)%、(70.48±7.72)%、(81.25±6.02)%，轉(zhuǎn)染siRNA-PIGF-3的基因沉默效應(yīng)最佳，因此選取siRNA-PIGF-3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、細(xì)胞PIGF mRNA及蛋白表達(dá)抑制率

轉(zhuǎn)染6 h后，siRNA-PIGF組、siRNA-NC組、未轉(zhuǎn)染組的PIGF mRNA表達(dá)量分別為(85.84±4.21)%、(98.32±3.56)%、100%；培養(yǎng)24 h后的表達(dá)量分別為(24.93±15.63)%、(88.64±7.65)%、100%。siRNA-PIGF組細(xì)胞PIGF mRNA水平在轉(zhuǎn)染6 h開始下降，24 h后較siRNA-NC組下降(63.72±8.20)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(75.07±8.25)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.792、8.319，P值均<0.05)，而未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-PIGF組細(xì)胞培養(yǎng)上清液PIGF蛋白含量較siRNA-NC組下降(42.92±1.34)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(46.25±3.64)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.602、6.853，P值均<0.01)，而未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、PIGF基因沉默對(duì)化療藥物敏感性的影響

吉西他濱處理后，siRNA-PIGF組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯著高于siRNA-NC組及未轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.31，P<0.05)，而5-氟尿嘧啶處理后雖然有抑制趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而阿霉素處理后3組的生長(zhǎng)抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。提示抑制PIGF表達(dá)可增強(qiáng)PANC1細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性。

化療藥物未轉(zhuǎn)染組siRNA-NC組siRNA-PIGF組Gem(ng/L) 0.039.64±1.5910.80±2.6417.77±1.66a 0.316.80±1.5718.33±2.2925.77±3.87a 331.01±1.0834.29±3.6044.35±5.05a5-FU(ng/L) 0.33.13±0.853.66±1.394.80±1.94 310.49±3.8912.52±2.7015.56±1.74 3023.26±3.9325.84±3.0227.95±3.12ADM(ng/L) 0.041.60±0.771.69±0.961.94±1.32 0.47.58±0.608.13±1.598.39±1.36 418.29±1.5018.79±0.8419.35±0.57

注：與未轉(zhuǎn)染組及siRNA-NC組比較，aP<0.05

四、細(xì)胞遷移和侵襲能力變化

遷移實(shí)驗(yàn)中siRNA-PIGF組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為siRNA-NC組、未轉(zhuǎn)染組的38.1%、40.8%(F=3.51，P<0.05，圖1)；侵襲實(shí)驗(yàn)中siRNA-PIGF組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為siRNA-NC組、未轉(zhuǎn)染組的28.2%、36.2%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.37，P<0.05，圖1)。提示PIGF均可顯著抑制PANC1細(xì)胞的遷移和侵襲。

討論

胰腺癌是嚴(yán)重危及人類健康的重大疾病，由于缺乏早期特異性臨床癥狀，且無(wú)有效臨床治療手段，特別是針對(duì)胰腺癌的傳統(tǒng)放化療療效并不理想，嚴(yán)重影響胰腺癌預(yù)后。惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段、多步驟、多因素參與的極其復(fù)雜的過(guò)程。Liotta等[8]曾在1991年提出腫瘤轉(zhuǎn)移“三步學(xué)說(shuō)”：腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分黏附，腫瘤細(xì)胞釋放或誘導(dǎo)釋放蛋白水解酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，降解區(qū)域腫瘤細(xì)胞在趨化因子引導(dǎo)下遷移。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入研究，尋找胰腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵性作用相關(guān)基因及基因治療已日益成為人們關(guān)注焦點(diǎn)，也是人類攻克惡性腫瘤的關(guān)鍵和希望所在[9]。

圖1　未轉(zhuǎn)染組(1A)、siRNA-NC組(1B)、siRNA-PIGF組(1C)PANC1細(xì)胞遷移(上)和侵襲(下)能力

PIGF是一種分泌型同源二聚體糖蛋白，通常在滋養(yǎng)層、正常甲狀腺以及傷口愈合期間高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分化、成熟。PIGF高表達(dá)最早于腎細(xì)胞癌血管中檢出，隨后的研究證實(shí)[5,10]，PIGF在胃癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤過(guò)度表達(dá)，且表達(dá)與腫瘤微血管密度成正比。

PIGF既可刺激血管源細(xì)胞形成新血管，還可刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌血管生成因子(如VEGF、bFGF等)及金屬蛋白酶(MMP-9、MMP-2)，分解腫瘤間質(zhì)，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成。同時(shí)PIGF也可直接作用于癌細(xì)胞，損傷樹突細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并刺激骨髓中血管生成祖細(xì)胞向腫瘤病灶轉(zhuǎn)移[10]。此外，PIGF還誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)性炎癥，激活炎癥因子和腫瘤相關(guān)因子，介導(dǎo)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控基因表達(dá)，為腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移提供微環(huán)境基礎(chǔ)，同時(shí)降解抑癌基因，從而使PIGF在腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Taylor等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PIGF通過(guò)ERK通路和細(xì)胞骨架的重新整合來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。Alpini等[12]構(gòu)建的肝癌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵蔡崾綪lGF過(guò)度表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。在直腸癌的相關(guān)研究中進(jìn)一步證實(shí)，PIGF表達(dá)與患者生存期呈負(fù)相關(guān)[13]。Rahbari等[14]報(bào)道，正常胰腺導(dǎo)管、腺體不表達(dá)PIGF mRNA和蛋白，僅在胰腺癌組織中表達(dá)，且表達(dá)程度強(qiáng)的胰腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性。

作為一種新興的基因治療技術(shù)，RNA干擾能夠高效、特異地調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞各種高級(jí)生命活動(dòng)。siRNA是RNA干擾技術(shù)重要的中間效應(yīng)分子，是研究基因功能和疾病治療的重要手段。本研究結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組比較，siRNA-PIGF組PANC1細(xì)胞的PIGF mRNA及蛋白表達(dá)顯著被抑制，遷移和侵襲能力顯著被削弱，但對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性顯著增強(qiáng)，提示沉默PIGF表達(dá)有可能成為胰腺癌靶向治療的潛在新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Seufferlein T, Bachet JB, Van Cutsem E, et al. Pancreatic adenocarcinoma: ESMO-ESDO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up[J]. Ann Oncol, 2012, 23(suppl 7):33-40. DOI:10.1093/annonc/mds224.

[2]楊尹默.胰腺癌外科治療的熱點(diǎn)與難點(diǎn)[J].中華消化外科雜志,2015,14(8):612-614.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2015.08.004.

[3]李學(xué)彥，郭曉鐘，李宏宇，等.胰腺癌198例臨床診治分析[J].中華胰腺病雜志,2015,15(2):120-122. DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.014.

[4]羅國(guó)培,倪泉興,虞先濬.胰腺癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].中華消化外科雜志,2015,14(8):686-688.DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-9752.2015.08.020.

[5]閆鵬飛, 劉煜. 胎盤生長(zhǎng)因子的生物活性及其與腫瘤相關(guān)作用研究進(jìn)展[J]. 藥物生物技術(shù), 2012, 19(3):265-269.

[6]Tugues S, Honjo S, K?nig C, et al. Genetic deficiency in plasma protein HRG enhances tumor growth and metastasis by exacerbating immune escape and vessel abnormalization[J]. Cancer Res, 2012, 72(8):1953-1963. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-11-2194.

[7]Solinas G, Schiarea S, Liguori M, et al. Tumor-conditioned macrophages secrete migration-stimulating factor: a new marker for M2-polarization, influencing tumor cell motility[J]. J Immunol, 2010, 185(1):642-652. DOI:10.4049/jimmunol.1000413.

[8]Liotta LA, Stetler-Stevenson WG. Tumor invasion and metastasis: an imbalance of positive and negative regulation[J]. Cancer Res, 1991, 51(suppl 18):5054s-5059s.

[9]李佳佳, 陳茵婷, 曾林涓, 等. 免疫納米微粒靶向胰腺癌細(xì)胞輸送siRNA的方法研究[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(9):1567-1573.DOI:10.3969/j.issn.1000-4718.2004.09.005.

[10]羅金龍, 姜淮蕪. 胎盤生長(zhǎng)因子與腫瘤的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2014, 21(8):1046-1050.

[11]Taylor AP，Leonand E，Goldenberg DM. Placental growth factor (PIGF) enhances breast cancer cell motilityby mobilising ERK1/2 phosphorylation and cytoskeletal rearrangement[J]. Brit J Cancer, 2010, 103(1):82-89. DOI: 10.1038/sj.bjc.6605746.

[12]Alpini G, Glaser SS, Zhang J, et al. Regulation of placenta growth factor by microRNA-125b in hepatocellular cancer[J]. J Hepatol, 2011, 55(6):1339-1345. DOI: 10.1016/j.jhep.2011.04.015.

[13]Waldner MJ, Neurath MF. Colitis-associated cancer: the role of T cells in tumor development[J]. Semin Immunopathol, 2009, 31(2):249-256. DOI: 10.1007/s00281-009-0161-8.

[14]Rahbari NN, Schmidt T, Falk CS, et al. Expression and prognostic value of circulating angiogenic cytokines in pancreatic cancer[J]. BMC Cancer, 2011,11:286. DOI: 10.1186/1471-2407-11-286.

(本文編輯：屠振興)

Effect of placental growth factor gene silencing on migration and invasion of human pancreatic carcinoma cell line PANC1

LiuJianhua,MaDong,ChenShaojie,LianGuoda,LiJiajia,HuangKaihong.

DepartmentofGastrointestinalOncology,Peoples′HospitalofGuangdongProvince,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510180,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of inhibiting placental growth factor (PIGF) by small interfering RNA (siRNA) on migration, invasion and chemoresistance of human pancreatic cancer cell line PANC1. MethodsThree specific siRNAs targeting PIGF (siRNA-PIGF) were designed. PANC1 cells were transfected with siRNA-PIGF by liposome transfection using untransfected cells as blank controls and nonspecific siRNA(siRNA-NC) transfected cells as negative controls. The PIGF mRNA and protein expression was examined by real-time RT-PCR and ELISA. MTT method was used to assess the inhibition rate of chemotherapeutic reagents on cell proliferation. The abilities of migration and invasion were evaluated by Transwell assay. ResultsThe inhibition rate of PIGF mRNA in PANC1 cells transfected by 3 siRNA-PIGF were (64.38±8.92)%, (70.48±7.72)% and(81.25±6.02)%, which was lowest in siRNA-PIGF-3 transfected cells. The expression of PIGF mRNA in PANC1 cells were decreased by (63.72±8.20)% at 24 h after siRNA-PIGF transfection compared with siRNA-NC transfected cells; and the level of PIGF protein in the supernatant of cultured PANC1 cells was lowered by (42.92±1.34)% compared with siRNA-NC transfected cells and by (46.25±3.64)% compared with untransfected cells at 48h after transfection, which all had significant difference. There was no statistical difference between untransfected and siRNA-NC transfected cells. After 3 ng/L gemicitabine treatment, the inhibition rate of cell proliferation in siRNA-PIGF group was even higher than that in siRNA-NC and untransfected group[(44.35±5.05)% vs(34.29±3.60)% and(31.01±1.08)%; both P<0.05], and no significant difference was not observed after 5-FU and adriamycin treatment. In migration and invasion assay, the number of transmembrane cells from siRNA-PIGF group was 38.1% and 28.2% of that from siRNA-NC group and 40.8% and 36.2% of that from untransfected group, which had statistical difference(all P<0.05).ConclusionsPIGF silencing could significantly suppress the migration and invasion of PANC1 cells and improve the sensitivity to gemicitabine.

【Key words】Pancreatic neoplasms;RNA, small interfering;Placental growth factor;Neoplasm invasiveness

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.004

通信作者：黃開紅，Emall: hkhem@163.com

基金項(xiàng)目:廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目資助(2013B021800233)

Corresponding author:Huang Kaihong, Emall: hkhem@163.com

(收稿日期：2016-01-03)