劉建化　馬冬　陳少杰　練國達　李佳佳　黃開紅

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·論著·

胎盤生長因子基因沉默對胰腺癌PANC1細胞遷移和侵襲的影響

劉建化馬冬陳少杰練國達李佳佳黃開紅

510180廣州，廣東省醫(yī)學科學院廣東省人民醫(yī)院胃腸腫瘤內(nèi)科

【摘要】目的探討胎盤生長因子(PIGF)基因沉默對人胰腺癌PANC1細胞遷移、侵襲能力及化療藥物耐藥性的影響。方法設(shè)計并合成3個靶向PIGF的siRNA(siRNA-PIGF)，以非特異性的siRNA(siRNA-NC)作為轉(zhuǎn)染的陰性對照，以未轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照。采用脂質(zhì)體法將siRNA轉(zhuǎn)染PANC1細胞，分別采用實時RT-PCR和ELISA法檢測各組細胞PIGF mRNA及蛋白表達抑制率；MTT法檢測化療藥物處理對各組細胞的生長抑制率；Transwell小室檢測細胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果轉(zhuǎn)染3個siRNA-PIGF的PANC1細胞PIGF mRNA表達抑制率分別為(64.38±8.92)%、(70.48±7.72)%、(81.25±6.02)%，以轉(zhuǎn)染siRNA-PIGF-3的基因沉默效應(yīng)最佳。轉(zhuǎn)染24 h后，siRNA-PIGF組細胞PIGF mRNA表達量較siRNA-NC組下降(63.72±8.20)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(75.07±8.25)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；轉(zhuǎn)染48 h后，培養(yǎng)上清液PIGF蛋白含量較siRNA-NC組下降(42.92±1.34)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(46.25±3.64)%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.01)，而未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組間的差異無統(tǒng)計學意義。3 ng/L吉西他濱處理后，siRNA-PIGF組細胞的生長抑制率顯著高于siRNA-NC組及未轉(zhuǎn)染組[(44.35±5.05)%比(34.29±3.60)%、(31.01±1.08)%]，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而5-氟尿嘧啶或阿霉素處理后3組的生長抑制率差異無統(tǒng)計學意義。在細胞遷移和侵襲實驗中，siRNA-PIGF組穿膜細胞數(shù)分別為siRNA-NC組的38.1%、28.2%，為未轉(zhuǎn)染組的40.8%、36.2%，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。結(jié)論PIGF 基因沉默能顯著抑制胰腺癌PANC1細胞的遷移與侵襲能力，能增強對化療藥物吉西他濱的敏感性。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤；RNA，小分子干擾；胎盤生長因子；腫瘤浸潤

Fund program: Science and Technology Commission Foundation of Guangdong Province(2013B021800233)

胰腺癌確診時多屬晚期，失去手術(shù)機會，且對化療不敏感，預后差[1-2]。影響胰腺癌預后的諸多因素中，除了理化環(huán)境、診治方法、分子生物學特征等，惡性腫瘤對周圍組織的浸潤和器官的轉(zhuǎn)移與預后也密切相關(guān)[3-4]。因此，深入探討胰腺癌侵襲與遷移的分子機制對提高胰腺癌療效具有重要理論意義和臨床指導價值。胎盤生長因子(placental growth factor，PIGF)是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族重要成員，作為調(diào)控血管生長的重要因子，能促進新生血管形成，同時對巨噬細胞也有趨化、聚集作用[5]。它在多種惡性腫瘤的生長、侵襲、血管生成和免疫逃避中扮演重要的角色[6]，并與腫瘤放化療敏感性降低有關(guān)，是抗腫瘤治療的靶點之一。有研究表明[7]，下調(diào)PIGF表達能抑制腫瘤生長及促進腫瘤血管正常化。目前關(guān)于PlGF 在胰腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用報道較少，本研究觀察PIGF基因沉默后對人胰腺癌PANC1細胞、遷移、侵襲、耐藥性等生物學行為的影響。

材料和方法

一、材料與試劑

人胰腺癌細胞株P(guān)ANC1(K-ras突變型)購自上海生物化學與細胞研究所；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液、Trizol、Lipofectamin2000購自美國Invitrogen公司；抗人PIGF ELISA試劑盒、Matrigel基底膜購自美國BD公司；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑(RNasin)購自Promega公司；Taq酶、dNTP、SYBR Green購自TaKaRa公司；PCR引物采用Primer Priemer 6.0軟件設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成；MTT購自Sigma公司；8μm微孔Transwell小室購自Corning公司。

二、siRNA設(shè)計、合成

根據(jù)siRNA的設(shè)計原則和PIGF基因序列，設(shè)計3對靶向PIGF基因的特異性siRNA序列。siRNA-PIGF-1序列為5′-AATTCAAAAAACGAACGTACTTGCAGATGTCTCTTGAACATCTGCAAGTACGT-TCG-3′；siRNA-PIGF-2序列為5′-AATTCAAAAAGATCCGCAGACGTGTAAATTCTCTTGAAATTTACA-CGTCTGCGGAT-3′；siRNA-PIGF-3序列為5′-AATTCAAAAAGGCAGAATCATCACGAAGTTCTCTTGAA-ACTTCGTGATGATTCTGC-3′。同時設(shè)計不針對任何靶基因的非特異性陰性對照siRNA(siRNA-NC)，序列為5′-UUCUCACCGCGAAUGUCGUTT-3′。siRNA由上海吉凱基因公司采用化學合成法合成。

三、siRNA轉(zhuǎn)染

PANC1細胞復蘇后常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞接種到6孔板，每孔6.0×105個細胞，培養(yǎng)到第2天待細胞60%融合時應(yīng)用脂質(zhì)體方法將各siRNA分別轉(zhuǎn)染PANC1細胞，按Lipofectamine 2000試劑盒說明書操作，以未轉(zhuǎn)染細胞作為對照組。轉(zhuǎn)染后4 h更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液。實驗重復5次。

四、實時RT-PCR

取上述轉(zhuǎn)染24 h的各組PANC1細胞，采用Trizol提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度和純度后，以總RNA為模板，采用SYBR Green染料法在羅氏熒光PCR儀進行熒光實時RT-PCR擴增。PIGF正義引物5′-ACGTGGAGCTGACGTTCTCT-3′，反義引物5′-CAGCAGGAGTCAC TGAAGAG-3′，擴增產(chǎn)物248 bp；以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH正義引物5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，反義引物5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′， 擴增產(chǎn)物150 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 1 min、55℃ 35 s，45個循環(huán)。擴增完畢進行熔解曲線分析，PIGF mRNA相對表達量用公式2-△△Ct計算， PIGF mRNA表達抑制率=(對照組PIGF mRNA表達量-轉(zhuǎn)染組PIGF mRNA表達量)/ 對照組PIGF mRNA表達量×100%。篩選PIGF基因沉默效應(yīng)最佳的siRNA-PIGF。

取沉默效應(yīng)最佳的siRNA-PIGF、siRNA-NC轉(zhuǎn)染6、24 h后的PANC1細胞，另取未轉(zhuǎn)染的PANC1細胞作為對照組，檢測各組細胞的PIGF mRNA表達，方法同上。以對照組的mRNA表達量為1，計算轉(zhuǎn)染組細胞的mRNA表達抑制率。

五、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

取上述3組培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)上清液，加入包被特異性抗體的96孔板，每孔100 μl，設(shè)4個復孔。應(yīng)用ELASA法檢測上清液中PIGF蛋白含量，按試劑盒說明書操作。依據(jù)標準品檢測結(jié)果繪制標準曲線，通過標準曲線的方程式計算待測標本的PIGF蛋白濃度。實驗重復3次，取均值。

六、MTT法

取上述3組培養(yǎng)24 h的對數(shù)生長期細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入0.03、0.3、3 ng/L的吉西他濱(Gem)，0.3、3、30 ng/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)，0.04、0.4、4 ng/L的阿霉素(ADM)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組每個藥物濃度設(shè)5個復孔。培養(yǎng)到時間點后，每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，上酶標儀測定570 nm波長處各孔的吸光度值(A570值)，以未加藥物處理細胞作為對照組，以空白孔調(diào)零。藥物對細胞生長的相對抑制率=(1-實驗組A570值/對照組A570值)×100%。

七、細胞遷移實驗

收集轉(zhuǎn)染48 h的細胞，PBS清洗后重懸于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液。取100 μl(2×105個)細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加500 μl 20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃平衡1 h后置 37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉棒擦凈未穿透濾膜的細胞，PBS沖洗后甲醛固定，Giemsa染色，顯微鏡下隨機取10個400倍視野，計算穿膜細胞數(shù)。實驗重復3次，取均值。

八、細胞侵襲實驗

將Matrigel按50 μl/cm2比例加到Transwell小室聚碳脂膜的上表面，37℃孵箱過夜待其凝固，其他步驟同細胞遷移實驗。實驗重復3次，取均值。

九、統(tǒng)計學處理

結(jié)果

一、PIGF基因沉默效應(yīng)的篩選

轉(zhuǎn)染3個siRNA-PIGF的PANC1細胞PIGF mRNA表達抑制率分別為(64.38±8.92)%、(70.48±7.72)%、(81.25±6.02)%，轉(zhuǎn)染siRNA-PIGF-3的基因沉默效應(yīng)最佳，因此選取siRNA-PIGF-3進行后續(xù)實驗。

二、細胞PIGF mRNA及蛋白表達抑制率

轉(zhuǎn)染6 h后，siRNA-PIGF組、siRNA-NC組、未轉(zhuǎn)染組的PIGF mRNA表達量分別為(85.84±4.21)%、(98.32±3.56)%、100%；培養(yǎng)24 h后的表達量分別為(24.93±15.63)%、(88.64±7.65)%、100%。siRNA-PIGF組細胞PIGF mRNA水平在轉(zhuǎn)染6 h開始下降，24 h后較siRNA-NC組下降(63.72±8.20)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(75.07±8.25)%，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.792、8.319，P值均<0.05)，而未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組間的差異無統(tǒng)計學意義。

轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA-PIGF組細胞培養(yǎng)上清液PIGF蛋白含量較siRNA-NC組下降(42.92±1.34)%，較未轉(zhuǎn)染組下降(46.25±3.64)%，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.602、6.853，P值均<0.01)，而未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組間的差異無統(tǒng)計學意義。

三、PIGF基因沉默對化療藥物敏感性的影響

吉西他濱處理后，siRNA-PIGF組細胞的生長抑制率顯著高于siRNA-NC組及未轉(zhuǎn)染組，差異均有統(tǒng)計學意義(F=2.31，P<0.05)，而5-氟尿嘧啶處理后雖然有抑制趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，而阿霉素處理后3組的生長抑制率差異無統(tǒng)計學意義(表1)。提示抑制PIGF表達可增強PANC1細胞對吉西他濱的敏感性。

化療藥物未轉(zhuǎn)染組siRNA-NC組siRNA-PIGF組Gem(ng/L) 0.039.64±1.5910.80±2.6417.77±1.66a 0.316.80±1.5718.33±2.2925.77±3.87a 331.01±1.0834.29±3.6044.35±5.05a5-FU(ng/L) 0.33.13±0.853.66±1.394.80±1.94 310.49±3.8912.52±2.7015.56±1.74 3023.26±3.9325.84±3.0227.95±3.12ADM(ng/L) 0.041.60±0.771.69±0.961.94±1.32 0.47.58±0.608.13±1.598.39±1.36 418.29±1.5018.79±0.8419.35±0.57

注：與未轉(zhuǎn)染組及siRNA-NC組比較，aP<0.05

四、細胞遷移和侵襲能力變化

遷移實驗中siRNA-PIGF組的穿膜細胞數(shù)分別為siRNA-NC組、未轉(zhuǎn)染組的38.1%、40.8%(F=3.51，P<0.05，圖1)；侵襲實驗中siRNA-PIGF組的穿膜細胞數(shù)分別為siRNA-NC組、未轉(zhuǎn)染組的28.2%、36.2%，差異均有統(tǒng)計學意義(F=4.37，P<0.05，圖1)。提示PIGF均可顯著抑制PANC1細胞的遷移和侵襲。

討論

胰腺癌是嚴重危及人類健康的重大疾病，由于缺乏早期特異性臨床癥狀，且無有效臨床治療手段，特別是針對胰腺癌的傳統(tǒng)放化療療效并不理想，嚴重影響胰腺癌預后。惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個多階段、多步驟、多因素參與的極其復雜的過程。Liotta等[8]曾在1991年提出腫瘤轉(zhuǎn)移“三步學說”：腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)成分黏附，腫瘤細胞釋放或誘導釋放蛋白水解酶降解細胞外基質(zhì)，降解區(qū)域腫瘤細胞在趨化因子引導下遷移。隨著對腫瘤發(fā)生機制的深入研究，尋找胰腺癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵性作用相關(guān)基因及基因治療已日益成為人們關(guān)注焦點，也是人類攻克惡性腫瘤的關(guān)鍵和希望所在[9]。

圖1　未轉(zhuǎn)染組(1A)、siRNA-NC組(1B)、siRNA-PIGF組(1C)PANC1細胞遷移(上)和侵襲(下)能力

PIGF是一種分泌型同源二聚體糖蛋白，通常在滋養(yǎng)層、正常甲狀腺以及傷口愈合期間高表達，促進細胞分化、成熟。PIGF高表達最早于腎細胞癌血管中檢出，隨后的研究證實[5,10]，PIGF在胃癌、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤過度表達，且表達與腫瘤微血管密度成正比。

PIGF既可刺激血管源細胞形成新血管，還可刺激腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌血管生成因子(如VEGF、bFGF等)及金屬蛋白酶(MMP-9、MMP-2)，分解腫瘤間質(zhì)，促進腫瘤新生血管的生成。同時PIGF也可直接作用于癌細胞，損傷樹突細胞，促進腫瘤生長，并刺激骨髓中血管生成祖細胞向腫瘤病灶轉(zhuǎn)移[10]。此外，PIGF還誘導腫瘤相關(guān)性炎癥，激活炎癥因子和腫瘤相關(guān)因子，介導不同的信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控基因表達，為腫瘤生長、轉(zhuǎn)移提供微環(huán)境基礎(chǔ)，同時降解抑癌基因，從而使PIGF在腫瘤生長、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Taylor等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PIGF通過ERK通路和細胞骨架的重新整合來促進乳腺癌細胞遷移和侵襲。Alpini等[12]構(gòu)建的肝癌實驗?zāi)Ｐ鸵蔡崾綪lGF過度表達能夠促進腫瘤生長。在直腸癌的相關(guān)研究中進一步證實，PIGF表達與患者生存期呈負相關(guān)[13]。Rahbari等[14]報道，正常胰腺導管、腺體不表達PIGF mRNA和蛋白，僅在胰腺癌組織中表達，且表達程度強的胰腺癌細胞具有更強的侵襲性。

作為一種新興的基因治療技術(shù)，RNA干擾能夠高效、特異地調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因表達，從而調(diào)控細胞各種高級生命活動。siRNA是RNA干擾技術(shù)重要的中間效應(yīng)分子，是研究基因功能和疾病治療的重要手段。本研究結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和siRNA-NC組比較，siRNA-PIGF組PANC1細胞的PIGF mRNA及蛋白表達顯著被抑制，遷移和侵襲能力顯著被削弱，但對化療藥物吉西他濱的敏感性顯著增強，提示沉默PIGF表達有可能成為胰腺癌靶向治療的潛在新靶點。

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(本文編輯：屠振興)

Effect of placental growth factor gene silencing on migration and invasion of human pancreatic carcinoma cell line PANC1

LiuJianhua,MaDong,ChenShaojie,LianGuoda,LiJiajia,HuangKaihong.

DepartmentofGastrointestinalOncology,Peoples′HospitalofGuangdongProvince,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510180,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of inhibiting placental growth factor (PIGF) by small interfering RNA (siRNA) on migration, invasion and chemoresistance of human pancreatic cancer cell line PANC1. MethodsThree specific siRNAs targeting PIGF (siRNA-PIGF) were designed. PANC1 cells were transfected with siRNA-PIGF by liposome transfection using untransfected cells as blank controls and nonspecific siRNA(siRNA-NC) transfected cells as negative controls. The PIGF mRNA and protein expression was examined by real-time RT-PCR and ELISA. MTT method was used to assess the inhibition rate of chemotherapeutic reagents on cell proliferation. The abilities of migration and invasion were evaluated by Transwell assay. ResultsThe inhibition rate of PIGF mRNA in PANC1 cells transfected by 3 siRNA-PIGF were (64.38±8.92)%, (70.48±7.72)% and(81.25±6.02)%, which was lowest in siRNA-PIGF-3 transfected cells. The expression of PIGF mRNA in PANC1 cells were decreased by (63.72±8.20)% at 24 h after siRNA-PIGF transfection compared with siRNA-NC transfected cells; and the level of PIGF protein in the supernatant of cultured PANC1 cells was lowered by (42.92±1.34)% compared with siRNA-NC transfected cells and by (46.25±3.64)% compared with untransfected cells at 48h after transfection, which all had significant difference. There was no statistical difference between untransfected and siRNA-NC transfected cells. After 3 ng/L gemicitabine treatment, the inhibition rate of cell proliferation in siRNA-PIGF group was even higher than that in siRNA-NC and untransfected group[(44.35±5.05)% vs(34.29±3.60)% and(31.01±1.08)%; both P<0.05], and no significant difference was not observed after 5-FU and adriamycin treatment. In migration and invasion assay, the number of transmembrane cells from siRNA-PIGF group was 38.1% and 28.2% of that from siRNA-NC group and 40.8% and 36.2% of that from untransfected group, which had statistical difference(all P<0.05).ConclusionsPIGF silencing could significantly suppress the migration and invasion of PANC1 cells and improve the sensitivity to gemicitabine.

【Key words】Pancreatic neoplasms;RNA, small interfering;Placental growth factor;Neoplasm invasiveness

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.03.004

通信作者：黃開紅，Emall: hkhem@163.com

基金項目:廣東省科技計劃項目資助(2013B021800233)

Corresponding author:Huang Kaihong, Emall: hkhem@163.com

(收稿日期：2016-01-03)