劉　宏，李　越，劉長(zhǎng)暉，劉　超，葛斌文，陳林麗（.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 廣東省法醫(yī)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50030；.無(wú)錫中德美聯(lián)生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫 474）

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24個(gè)Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

劉宏1，李越1，劉長(zhǎng)暉1，劉超1，葛斌文2，陳林麗2
（1.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 廣東省法醫(yī)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510030；2.無(wú)錫中德美聯(lián)生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫 214174）

摘要：目的 構(gòu)建包含24個(gè)Y-STR基因座的熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系。方法 選擇DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、Y-GATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b、DYS444 24個(gè)Y-STR基因座，構(gòu)建熒光復(fù)合擴(kuò)增體系。檢測(cè)該體系的特異性、同一性、靈敏度、擴(kuò)增均衡性、抗干擾性和準(zhǔn)確性，調(diào)查其在廣東地區(qū)人群的基因多樣性。結(jié)果 建立的復(fù)合擴(kuò)增體系在檢測(cè)的非人類(lèi)及女性樣本中未發(fā)現(xiàn)譜帶，同一個(gè)體不同組織檢測(cè)結(jié)果一致，0.1ng以上標(biāo)準(zhǔn)品9948可檢測(cè)獲得完整分型結(jié)果。常見(jiàn)抑制物中體系內(nèi)加入120～200μmol/L血紅素、1.5～2.0mmol/L鈣離子時(shí)出現(xiàn)等位基因丟失，對(duì)靛藍(lán)、腐殖酸、EDTA具有較強(qiáng)抗干擾性。通過(guò)146例無(wú)關(guān)個(gè)體與Yfiler系統(tǒng)平行檢測(cè)比對(duì)，24 Y-STR檢測(cè)體系分型準(zhǔn)確。廣東地區(qū)人群?jiǎn)伪缎投鄻有裕℉D）為0.99972，優(yōu)于Yfiler系統(tǒng)（HD=0.99858）。結(jié)論 本研究建立的24個(gè)Y-STR基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景廣闊，可用于案件檢驗(yàn)、親權(quán)鑒定與Y-STR數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；Y染色體；短串聯(lián)重復(fù)序列；熒光復(fù)合擴(kuò)增

熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)是目前應(yīng)用最廣泛的檢驗(yàn)技術(shù)之一［1］，基于這一技術(shù)開(kāi)發(fā)的各種商品化試劑盒，如PowerPlex?Y試劑盒與AmpFeSTR?Yfiler?試劑盒（簡(jiǎn)稱(chēng)Yfiler試劑盒）等，已經(jīng)在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用［2］。但這些試劑盒主要選取歐美人群的推薦基因座進(jìn)行研發(fā)，其中不少基因座在中國(guó)人群中多態(tài)性較低，如在中國(guó)人群中的基因多樣性（GD）DYS391小于0.4［3］、DYS438小于0.5［4］，加之基因座數(shù)量少，導(dǎo)致檢驗(yàn)系統(tǒng)在中國(guó)人群中整體識(shí)別力低，在

1　材料與方法

1.1樣本及模板制備

種屬特異性檢測(cè)樣本：牛、羊、豬、貓、狗、雞、鼠、魚(yú)和大腸桿菌樣本（來(lái)源于廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所科研積累）。性別特異性檢測(cè)樣本：女性無(wú)關(guān)個(gè)體血樣10例。個(gè)體同一性檢測(cè)樣本：同一男性個(gè)體取肌肉組織、血痕、口腔拭子共10例。準(zhǔn)確性及基因多樣性檢測(cè)樣本：男性無(wú)關(guān)個(gè)體血樣146例（在知情同意下取自廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所日常檢案）。上述樣本采用Freedom EVO工作站（瑞士Tecan公司）提取DNA［6］。

靈敏度檢測(cè)模板制備：取標(biāo)準(zhǔn)品9948（美國(guó)Ori-Gene公司）加水稀釋至每份模板含9948分別為1.0、0.5、0.25、0.1、0.05、0.02ng。

抗干擾性檢測(cè)模板制備：分5組，向0.5 ng標(biāo)準(zhǔn)品9948中，分別加入血紅素、靛藍(lán)、腐殖酸、鈣離子、EDTA等抑制物。模板中抑制物濃度分別為：血紅素80、120、160、200μmoL/L，靛藍(lán)500、750、1000μmoL/L，腐殖酸5、10、20 ng/μL，鈣離子1.0、1.5、2.0 mmoL/L，EDTA 0.6、0.8、1.0μmoL/L。

1.2引物序列、熒光標(biāo)記與引物濃度

Y-STR檢測(cè)體系引物序列、引物濃度及熒光標(biāo)記見(jiàn)表1。熒光標(biāo)記引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

表1　24 Y-STR檢測(cè)體系引物序列、體系引物濃度、熒光標(biāo)記及產(chǎn)物片段大小

續(xù)表1

1.3復(fù)合擴(kuò)增體系、擴(kuò)增程序與電泳檢測(cè)

擴(kuò)增體系組成：PCR緩沖混合液（Tris-HCl buffer 125 mmoL/L，KCl 125 mmoL/L，dNTPs 7.5 mmoL/L、MgCl22.0mmoL/L）10.0μL；引物（濃度0.04～1μmol/L，見(jiàn)表1）5.0μL；熱啟動(dòng)Taq酶（5U/μL）0.8μL；DNA模板與ddH2O補(bǔ)足至25.0μL。擴(kuò)增程序：95℃ 11min；94℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；60℃60min。擴(kuò)增產(chǎn)物在3130xl型遺傳分析儀上電泳。

1.4等位基因命名及等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備

使用非熒光標(biāo)記引物對(duì)無(wú)關(guān)個(gè)體樣本進(jìn)行單基因座擴(kuò)增，DYS385a/b、DYS527a/b與DYS459a/b雙拷貝基因座等位基因數(shù)為2時(shí)，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后，切取不同片段大小條帶，進(jìn)行純化回收，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果按重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)命名各等位基因。選取不同等位基因樣本，用熒光標(biāo)記引物單基因座擴(kuò)增后混合擴(kuò)增產(chǎn)物，制成等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。

1.5準(zhǔn)確性檢測(cè)與基因多樣性統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)146例廣東地區(qū)男性無(wú)關(guān)個(gè)體，應(yīng)用本研究建立的24 Y-STR檢測(cè)體系與Yfiler試劑盒平行檢測(cè)。DYS385a/b、DYS527a/b與DYS459a/b為雙拷貝基因座，分型結(jié)果作為一個(gè)單倍型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。比較兩系統(tǒng)共有的DYS365、DYS385a/b基因座分型結(jié)果。用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各等位基因頻率，基因座第i個(gè)等位基因的頻率Pi=第i個(gè)等位基因頻數(shù)/n（n為群體樣本數(shù)）。GD及單倍型多樣性（HD），按公式HD=n（1-∑Pi2）/（n-1）計(jì)算，n為樣本例數(shù)，Pi為等位基因（或單倍型）頻率。并計(jì)算累積GD值（TGD），按公式TGD＝1-（1-GD1）（1-GD2）……（1-GDn）計(jì)算，GDn為各基因座的GD值。

2　結(jié)果

2.124 Y-STR檢測(cè)體系性能評(píng)估

本研究建立的24 Y-STR檢測(cè)體系，等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物峰高均衡、明確，等位基因覆蓋完整（圖1）。

特異性檢測(cè)結(jié)果：對(duì)牛、羊、豬、貓、狗、雞、鼠、魚(yú)和大腸桿菌等種屬樣本及女性無(wú)關(guān)個(gè)體樣本檢驗(yàn)結(jié)果均未檢見(jiàn)譜帶。

個(gè)體同一性檢測(cè)結(jié)果：對(duì)10例男性個(gè)體肌肉、血痕、口腔拭子樣本檢測(cè)，結(jié)果均獲得相同分型。

靈敏度檢測(cè)結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)品9948模板量在0.1～1ng時(shí)所有基因座結(jié)果準(zhǔn)確、均衡，無(wú)非特異性峰，同色熒光RFU值差異小于50%（圖2），0.05、0.02 ng模板量出現(xiàn)等位基因丟失。

抗干擾性檢測(cè)結(jié)果：對(duì)加入不同抑制物的0.5ng標(biāo)準(zhǔn)品9948進(jìn)行檢測(cè)，除加入血紅素濃度為120～200μmoL/L、鈣離子濃度為1.5～2.0mmoL/L時(shí)出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，其他均未出現(xiàn)等位基因丟失。

準(zhǔn)確性檢測(cè)結(jié)果：通過(guò)146例男性無(wú)關(guān)個(gè)體樣本批量檢測(cè)，各樣本均能有效、明確獲得目標(biāo)Y-STR基因座分型，未發(fā)現(xiàn)影響結(jié)果判讀的非特異性峰。與Yfiler試劑盒比對(duì)檢測(cè)，兩系統(tǒng)在共有的DYS635、DYS385a/b基因座結(jié)果一致，說(shuō)明24 Y-STR檢測(cè)體系結(jié)果準(zhǔn)確可信。

2.2系統(tǒng)基因多樣性及與Yfiler系統(tǒng)基因多樣性比較

經(jīng)計(jì)算，24 Y-STR檢測(cè)體系共得到145種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，GD值為0.55（DYS531）～0.96（DYS385a/b），HD值為0.999 72，TGD值為1-1.88×10-14；Yfiler系統(tǒng)共得到143種單倍型，其中141種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，1種單倍型出現(xiàn)3次，單位點(diǎn)GD值為0.36（DYS389）～0.96（DYS385a/b），HD值為0.998 58，TGD值為1-4.97×10-9；24 Y-STR檢測(cè)體系與Yfiler系統(tǒng)聯(lián)用共得到145種單倍型，其中144種單倍型出現(xiàn)1次，1種單倍型出現(xiàn)2次，HD值為0.99972，TGD值為1-1.066×10-20。

3　討論

本研究旨在建立一種針對(duì)中國(guó)人群的高識(shí)別力Y-STR多基因座熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系，作為目前常用商品化試劑盒的補(bǔ)充，以解決在日常Y-STR檢驗(yàn)過(guò)程中遇到的系統(tǒng)識(shí)別力低的難題，為大規(guī)模YSTR家系比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)提供更多的基因座檢測(cè)試劑。因此，該系統(tǒng)既要有較高的識(shí)別力來(lái)滿足大樣本數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的要求，同時(shí)還要性能穩(wěn)定。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，本研究建立的24 Y-STR檢測(cè)體系種屬及性別特異性好、個(gè)體同一性好、檢測(cè)靈敏度高，對(duì)血紅素、靛藍(lán)、腐殖酸、鈣離子、EDTA等常見(jiàn)抑制劑抗干擾性較強(qiáng)，性能穩(wěn)定，結(jié)果可靠，檢測(cè)峰值均衡，分型易讀，操作簡(jiǎn)單，具有進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)146例男性無(wú)關(guān)個(gè)體的群體遺傳學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，針對(duì)所檢測(cè)的廣東地區(qū)人群，本研究選取的24個(gè)Y-STR基因座其遺傳多樣性從整體上要優(yōu)于Yfiler試劑盒17個(gè)Y-STR基因座。24 YSTR檢測(cè)體系中GD值小于0.7的基因座僅為3個(gè)（DYS531、DYS520、Y-GATA-A10）占12.5%，TGD值為1-1.88×10-14，而Yfiler試劑盒所包含的17個(gè)Y-STR基因座在相同人群中GD值小于0.7的基因座為10個(gè)（DYS439、DYS390、DYS456、DYS389I、DYS19、DYS438、Y-GATA-H4、DYS391、DYS393、DYS437），占58.8%，TGD值為1-4.97×10-9，特別是DYS391、DYS438兩個(gè)基因座在所統(tǒng)計(jì)人群中GD值僅為0.41和0.36，說(shuō)明本研究建立的Y-STR檢測(cè)體系所選取的基因座針對(duì)所統(tǒng)計(jì)人群具有更好的基因多樣性，這與本研究的預(yù)定目標(biāo)一致。在相同的人群中本研究建立的24 Y-STR檢測(cè)體系共獲得了145種單倍型，多于Yfiler試劑盒獲得的141種單倍型，在人群中具有更高的HD值。總之，本研究建立的24 Y-STR檢測(cè)體系作為針對(duì)中國(guó)人群而設(shè)計(jì)研制的高識(shí)別率Y-STR檢測(cè)系統(tǒng)比目前最常用的商業(yè)化Yfiler試劑盒，針對(duì)所統(tǒng)計(jì)的廣東地區(qū)男性人群具有更好的基因多樣性與識(shí)別能力，特別是與Yfiler試劑盒聯(lián)用時(shí)，有效YSTR檢測(cè)數(shù)量可以達(dá)到38個(gè)，TGD值可以達(dá)到1-1.066×10-20，可以應(yīng)用于法醫(yī)DNA日常檢驗(yàn)，在YSTR數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)上應(yīng)用前景廣闊。

參考文獻(xiàn)：

［1］王永在，榮遼江，歐拉.法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的現(xiàn)狀及發(fā)展［J］.刑事技術(shù)，2005，（2）：28-30.

［2］陳曉輝，李紅霞，葛璐璐.應(yīng)用Y染色體及常染色體STR檢驗(yàn)成功串并兩宗命案［J］.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（S0）：84.

［3］Tang JP，Hou YP，Li YB，et al.Characterization of eight Y-STR loci and haplotypes in a Chinese Han population［J］.Int J Legal Med，2003，117（5）：263-270.

［4］Dai HL，Wang XD，Li YB，et al.Characterization and haplotype analysis of 10 novel Y-STR loci in Chinese Han population［J］.Forensic Sci Int，2004，145（1）：47-55.

［5］Shi M，Bai R，Yu X，et al.Haplotype diversity of 22 Y-chromosomal STRs in a southeast China population sample（Chaoshan area）［J］.ForensicSciInt Genet，2009，3（2）：e45-e47.

［6］楊電，劉宏，劉超，等.國(guó)產(chǎn)磁珠結(jié)合自動(dòng)化工作站批量提取生物檢材DNA的應(yīng)用［J］.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（6）：404-406.

（本文編輯：李成濤）

中圖分類(lèi)號(hào)：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.005

文章編號(hào)：1004-5619（2016）03-0180-04

基金項(xiàng)目：廣東省法醫(yī)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（2010A06 0801001）；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013B021500010）

作者簡(jiǎn)介：劉宏（1979—），男，碩士，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA檢驗(yàn)和研究；E-mail：79liuhong@163.com

通信作者：劉超，男，博士，主任法醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E-mail：liuchaogzf@163.com實(shí)際應(yīng)用中有局限性，特別是近年隨著Y-STR技術(shù)的拓展應(yīng)用，在很多案件中Y-STR數(shù)據(jù)被用來(lái)進(jìn)行群體和家系排查，現(xiàn)有Y-STR檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別力不能滿足實(shí)際應(yīng)用需求，也成為建立大區(qū)域Y-STR數(shù)據(jù)庫(kù)的瓶頸。因此，研發(fā)一種針對(duì)中國(guó)人群的高識(shí)別力Y-STR檢測(cè)新體系十分必要。本研究根據(jù)近年國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道［5］選取在中國(guó)人群中多樣性較高，且等位基因片段長(zhǎng)度差距小的DYS531、DYS630、DYS622、DYS552、DYS510、DYS449、DYS459a/b、DYS446、DYS443、DYS635、DYS587、DYS527a/b、DYS460、YGATA-A10、DYS520、DYS557、DYS522、DYS481、DYS570、DYS385a/b和DYS444共24個(gè)基因座建立復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱(chēng)24 Y-STR檢測(cè)體系），其中DYS385a/b、DYS527a/b與DYS459a/b為雙拷貝基因座，上述基因座中未包括在現(xiàn)有商品試劑盒體系內(nèi)的基因座有21個(gè)，與Yfiler試劑盒體系相同的基因座有3個(gè)（DYS635、DYS385a/b）。

收稿日期：（2015-04-03）

Development of a Fluorescence Multiplex Amplification System with 24 Y-STR Loci

LIU Hong1，LI Yue1，LIU Chang-hui1，LIU Chao1，GE Bin-wen2，CHEN Lin-li2
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Forensic Genetics，Guangzhou Institute of Forensic Science，Guangzhou 510030，China；2.AGCU ScienTech Incorporation，Wuxi 214174，China）

Abstract：Objective To establish a novel multiplex amplification system which comprises 24 Y-STR loci.Methods Total 24 Y-STR gene loci，concluding DYS531，DYS630，DYS622，DYS552，DYS510，DYS449，DYS459a/b，DYS446，DYS443，DYS635，DYS587，DYS527a/b，DYS460，Y-GATA-A10，DYS520，DYS557，DYS522，DYS481，DYS570，DYS385a/b，DYS444，were chosen for establishing the fluorescence multiplex amplification system.The specificity，identity，sensitivity，balance of the amplification，anti-interference and accuracy of the system were detected and the gene diversity was investigated in the population of Guangdong.Results No band was found in nonhuman and female samples that were tested by the established multiplex amplification system.The same genotyping results were obtained from different tissues of the same person.Complete profiles could be obtained from more than 0.1 ng of the standard sample 9948.The loss of alleles was found when the common inhibitors such as hemoglobin and calcium ion were added 120-200μmol/L and 1.5-2.0mmol/L respectively to the system which with a strong anti-interference to the indigo，humic acid and EDTA.The typing of 24 Y-STR system could give the reliable results when 146 unrelated male individuals were detected and compared with the Yfiler system parallelly.The haplotype diversity（HD）of the population in Guangdong reached 0.999 72 that was better than the result retained from Yfiler system，which the HD was 0.998 58.Conclusion The fluorescence amplification system with 24 Y-STR loci established in present study has a wildly application prospect and can be used for cases inspection，paternity tests and Y-STR database construction.

Key words：forensic genetics；Y chromatosome；tandem repeat sequences；fluorescent multiplex amplification