呂葉輝，李志宏，托　婭，劉　麗，李　堃，卞　杰，馬劍龍，陳　龍（．上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 038；．復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 0003）

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不同溫度下大鼠腦組織RNA降解與早期PMI的相關(guān)性

呂葉輝1，李志宏1，托婭1，劉麗1，李堃1，卞杰1，馬劍龍2，陳龍2
（1．上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201318；2．復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032）

摘要：目的 探討大鼠腦組織8種RNA指標(biāo)，在不同溫度下的表達(dá)水平與早期死亡時(shí)間（PMI）的相關(guān)性。方法 將222只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（死后0h）和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組斷頸處死后分別置于5℃、15℃、25℃和35℃的環(huán)境中，于死后1～24 h內(nèi)9個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取腦組織RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測8種RNA指標(biāo)（β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9及miRNA-125b）的表達(dá)水平，geNorm軟件選取合適內(nèi)參，SPSS軟件對(duì)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化RNA指標(biāo)進(jìn)行回歸分析，R軟件構(gòu)建推斷PMI的數(shù)學(xué)模型，另選6只已知PMI的SD大鼠予以驗(yàn)證。結(jié)果 5S rRNA、miR-9和miR-125b表達(dá)穩(wěn)定，可作為內(nèi)參指標(biāo)。β-actin和GAPDH具有良好的時(shí)序性降解規(guī)律，在24h內(nèi)隨PMI延長不斷降解。R軟件擬合得ΔCt值隨PMI和溫度變化的數(shù)學(xué)模型可用以推斷PMI。運(yùn)用β-actin和GAPDH驗(yàn)證模型的平均誤差率分別為14.1%和22.2%。結(jié)論 β-actin和GAPDH表達(dá)水平與PMI和環(huán)境溫度相關(guān)性良好。本研究建立的數(shù)學(xué)模型可為溫度變化條件下的早期PMI推斷提供參考。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)病理學(xué)；RNA；死亡時(shí)間；溫度；降解；大鼠

死亡時(shí)間（PMI）是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔，PMI的精確推斷有助于迅速確定涉案罪犯以及排除嫌疑人，為偵查部門提供重要線索，并為司法實(shí)踐提供重要科學(xué)依據(jù)。利用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行PMI推斷，其結(jié)果易受主觀因素和外界環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致推斷的精確性較低。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，利用RNA的時(shí)間依賴性降解規(guī)律推斷PMI正逐漸成為研究熱點(diǎn)［1］，但針對(duì)RNA在不同溫度下早期PMI降解規(guī)律的研究較少。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：9700型PCR擴(kuò)增儀、Prism 7500型熒光定量PCR儀（美國AB公司），NanoDrop 1000分光光度計(jì)（美國Thermo公司），Agilent 2100生物分析儀（美國Agilient公司）。

試劑：TRIzol試劑盒（美國 Invitrogen公司），RNAlater保護(hù)液、PrimeScriptTMRT試劑盒、One Step PrimeScriptTMmiRNA cDNA Synthesis試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫高壓滅菌的MiliQ純水）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

清潔級(jí)成年雄性SD大鼠228只，體質(zhì)量（220± 20）g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，隨機(jī)選取其中6只備用，其余222只大鼠斷頸處死后隨機(jī)分為對(duì)照組（死后即刻0h，6只）和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組（每組54只）。實(shí)驗(yàn)組大鼠尸體分別置于（5±1）℃、（15±1）℃、（25±1）℃和（35±1）℃環(huán)境中，并分別在死后1、3、6、9、12、15、18、21、24 h（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只）提取大鼠額葉腦組織50～100mg。另取6只備用的大鼠，斷頸處死后隨機(jī)分為3組，尸體分別置于（10±1）℃、（20±1）℃和（30±1）℃環(huán)境中，并分別在死后10、20h（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)1只）提取大鼠額葉腦組織50～100 mg，用以驗(yàn)證數(shù)學(xué)模型。所取腦組織均用無菌眼科剪剪碎后分裝于RNAlater保護(hù)液中，置于-80℃凍存。

1.3總RNA提取

準(zhǔn)確稱取腦組織質(zhì)量，加入液氮研碎組織后轉(zhuǎn)入勻漿器中，按照TRIzol試劑盒總RNA提取說明書操作步驟提取總RNA，加入30μL DEPC水溶解后置于-80℃凍存。NanoDrop 1000分光光度計(jì)測定RNA的純度及濃度，用光密度（D）表示，并檢測D260/D280值。Agilent 2100生物分析儀測定RNA完整性，用RNA完整性指數(shù)（RNA integrity number，RIN）表示。

1.4指標(biāo)選擇

本研究選擇8種RNA指標(biāo)，分別為β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、核糖體蛋白S29 （ribosomal protein S29，RPS29）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）、5S核糖體RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）、微小RNA-9（miRNA-9，miR-9）及微小RNA-125b（miRNA-125b，miR-125b）。引物設(shè)計(jì)至少跨一個(gè)外顯子或外顯子區(qū)域以保證cDNA正確的合成與擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度均在200bp以下。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)選取的RNA指標(biāo)及引物序列

1.5總RNA反轉(zhuǎn)錄

應(yīng)用PrimeScriptTMRT試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以用于β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。取RNA樣本500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書配置10μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，1個(gè)循環(huán)。應(yīng)用One Step PrimeScriptTMmiRNA cDNA Synthesis試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以用于5S rRNA、U6 snRNA、miR-9、miR-125b的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。取RNA樣本500ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒說明書配置10μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：37℃ 60 min，85℃ 5 s，1個(gè)循環(huán)。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA以1∶10稀釋，置于-20℃凍存。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR

應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。按照試劑盒說明書配制20 μL反應(yīng)體系，并應(yīng)用Prism 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃ 30s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)三次，結(jié)果由系統(tǒng)自動(dòng)生成，從而得到各個(gè)RNA指標(biāo)的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.7.1RNA濃度及完整性檢測

運(yùn)用SPSS v22.0（美國SPSS公司）對(duì)RNA單位質(zhì)量濃度及RIN進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間運(yùn)用單因素方差分析，兩組間運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.7.2內(nèi)參選擇

運(yùn)用geNorm v3.5軟件（比利時(shí)Biogazelle公司）［2］對(duì)RNA指標(biāo)的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定度M值確定最穩(wěn)定的指標(biāo)，M值越小，指標(biāo)的穩(wěn)定性越高。根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定度的配對(duì)變異V值判斷引入新的內(nèi)參指標(biāo)是否會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化因子產(chǎn)生顯著影響，默認(rèn)V值為0.15，如果Vn/Vn+1（n＞1）小于0.15（當(dāng)多個(gè)V值符合時(shí)選取最小值），說明n或n+1個(gè)RNA指標(biāo)可以作為內(nèi)參指標(biāo)使用。除內(nèi)參指標(biāo)外，其余RNA指標(biāo)作為候選指標(biāo)。

1.7.3模型建立

運(yùn)用SPSS v22.0、Excel 2010（美國Microsoft公司）軟件對(duì)候選RNA指標(biāo) Ct值進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化（ΔCt=Ct候選指標(biāo)-Ct內(nèi)參均值），內(nèi)參均值為內(nèi)參指標(biāo)的幾何平均數(shù)，并對(duì)不同溫度組下候選RNA指標(biāo)ΔCt值及PMI進(jìn)行三次方回歸分析并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，平均相關(guān)系數(shù)較高的候選指標(biāo)將被用于構(gòu)建模型。運(yùn)用R v3.2.3軟件（美國RStudio公司）構(gòu)建以溫度（x）、PMI（y）為自變量，ΔCt值（z）為因變量的三元二次方程，即z=k1x2+k2x+k3xy+k4y+k5y2+k0。使用MATLAB v7.0軟件（美國MathWorks公司）將方程轉(zhuǎn)為三維可視化數(shù)學(xué)模型。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

1.7.4模型驗(yàn)證

將已知PMI的備用大鼠樣本數(shù)據(jù)代入模型進(jìn)行驗(yàn)證，并計(jì)算推斷PMI和實(shí)際PMI之間的差異程度，用推斷誤差及誤差率表示，推斷誤差=|PMI推斷-PMI實(shí)際|，誤差率=|PMI推斷-PMI實(shí)際|/PMI實(shí)際×100%。

2　結(jié)果

2.1RNA純度、濃度、完整性及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

測得所有RNA樣本的D260/D280均在1.8～2.0，證明RNA純度較高。各組間RNA單位質(zhì)量濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組RIN值為9.45±0.08 （9.2～9.7），5℃組為9.20±0.11（8.6～9.6），15℃組為8.40±0.25（7.2～9.6），25℃組為7.42±0.55（4.8～9.2），35℃組為7.06±0.73（3.5～9.4）。與對(duì)照組相比，5℃組RIN值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而15℃、25℃和35℃組RIN值降低（P＜0.05），表明在較高溫度下RNA逐漸降解，其完整性隨PMI延長逐漸降低。

所有樣品均成功反轉(zhuǎn)，得到Ct值。擴(kuò)增曲線和溶解曲線完好，表明樣本均成功特異性擴(kuò)增。

2.2內(nèi)參選擇結(jié)果

4個(gè)不同溫度組的RNA指標(biāo)的平均表達(dá)穩(wěn)定度M值及標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異Vn/Vn+1值，如表2所示。以5℃組為例，RNA指標(biāo)平均表達(dá)穩(wěn)定度M值由高到低排序依次為β-actin＞GAPDH＞18S rRNA＞RPS29＞U6 snRNA＞miR-9＞5S rRNA=miR-125b，表明5S rRNA和miR-125b穩(wěn)定性最好，而β-actin和GAPDH較不穩(wěn)定；相比其他Vn/Vn+1值，V3/V4小于0.15且最小，表明選擇3個(gè)或4個(gè)RNA指標(biāo)作為5℃組內(nèi)參最為合適，即miR-9、5S rRNA、miR-125b或U6 snRNA、miR-9、5S rRNA、miR-125b。

表2　不同溫度組RNA指標(biāo)的穩(wěn)定性對(duì)比

以此類推，15℃組內(nèi)參為miR-9、5S rRNA、miR-125b或 U6 snRNA、miR-9、5S rRNA、miR-125b；25℃組內(nèi)參為miR-9、miR-125b或5S rRNA、miR-9、miR-125b；35℃組內(nèi)參為miR-9、miR-125b或5S rRNA、miR-9、miR-125b。

綜合4個(gè)溫度組對(duì)RNA指標(biāo)進(jìn)行分析，5S rRNA、miR-9和miR-125b在各溫度組均有較好的穩(wěn)定性；U6 snRNA在5℃、15℃組相對(duì)穩(wěn)定，但在25℃、35℃組穩(wěn)定性下降；β-actin和GAPDH在4個(gè)溫度組中均不穩(wěn)定。因此，4個(gè)溫度組均選擇5S rRNA、miR-9和miR-125b作為內(nèi)參指標(biāo)，其余RNA指標(biāo)作為候選指標(biāo)。

2.3PMI推斷的模型建立

對(duì)候選RNA指標(biāo)的Ct值進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化，即Ct內(nèi)參均值=（Ct5S rRNA×CtmiR-9×CtmiR-125b）1/3。利用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)4個(gè)溫度組內(nèi)5種候選RNA指標(biāo)的ΔCt值和PMI進(jìn)行三次方回歸分析并計(jì)算相關(guān)系數(shù)r，如表3所示。

表3　不同溫度組內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化的RNA指標(biāo)與PMI的相關(guān)性分析（r值）

結(jié)果表明，18S rRNA、RPS29和U6 snRNA在5℃、15℃時(shí)與PMI相關(guān)性較低，但在25℃、35℃時(shí)與PMI相關(guān)性提高；β-actin和GAPDH在4個(gè)溫度組內(nèi)都與PMI有著良好的相關(guān)性，且β-actin和GAPDH的平均r值均高于0.87；因此選擇β-actin和GAPDH用于構(gòu)建推斷PMI的數(shù)學(xué)模型。

運(yùn)用R v3.2.3軟件構(gòu)建三元二次方程，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明x、xy、y、y2、k0項(xiàng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），重新計(jì)算后得到β-actin的方程為z=0.0048x+0.0023xy+ 0.033 1 y-0.001 5 y2+3.567 7，GAPDH的方程為z= -0.002 7 x+0.003 0 xy+0.028 3 y-0.000 5 y2+2.650 8；決定系數(shù)R2分別為0.9375和0.9017，表明擬合優(yōu)度較高。

使用MATLAB v7.0軟件將方程轉(zhuǎn)為三維可視化數(shù)學(xué)模型，β-actin和GAPDH的模型如圖1～2所示。結(jié)果顯示，早期PMI內(nèi)，β-actin和GAPDH的ΔCt值隨著PMI延長不斷增加，而且ΔCt值增加的速率不僅與PMI相關(guān)，也與環(huán)境溫度相關(guān)。

2.4PMI推斷的模型驗(yàn)證

運(yùn)用R軟件將6只備用大鼠樣本的ΔCt值及溫度分別代入β-actin、GAPDH模型進(jìn)行驗(yàn)證，分別得到兩者的PMI推斷值，并計(jì)算推斷PMI與實(shí)際PMI的誤差率，如表4所示。運(yùn)用β-actin模型進(jìn)行PMI推斷，平均推斷誤差為1.9h，平均誤差率為14.1%；運(yùn)用GAPDH模型進(jìn)行PMI推斷，平均推斷誤差為3.0h，平均誤差率為22.2%。對(duì)于環(huán)境溫度較高（30℃）、PMI較長（20 h）的樣本，運(yùn)用該模型進(jìn)行PMI推斷時(shí)，推斷誤差和誤差率相對(duì)較低。

表4　β-actin和GAPDH數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證結(jié)果

3　討論

早期PMI（24 h內(nèi)）是指尸體未出現(xiàn)明顯腐敗現(xiàn)象的時(shí)期，對(duì)于法醫(yī)鑒定來說更常用也更重要，因此早期PMI的精確推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用生物體內(nèi)大分子來推斷PMI成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，尤其是依據(jù)RNA的時(shí)間依賴性降解規(guī)律推斷PMI已經(jīng)取得了一些進(jìn)展［3］。由于RNA的降解不僅與PMI有關(guān)，在很大程度上也受到環(huán)境溫度的影響，因此相關(guān)研究也會(huì)考慮此影響因素，但多數(shù)研究僅將實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定在室溫或單個(gè)環(huán)境溫度下［4-5］，而在實(shí)際檢案中尸體處于不斷變化的環(huán)境溫度中，因此單一的實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)定會(huì)限制其實(shí)用性。本研究設(shè)定4個(gè)連續(xù)溫度的實(shí)驗(yàn)組，即5℃、15℃、25℃和35℃，選擇受其他因素影響較小的腦組織作為檢材，8種RNA作為指標(biāo)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RNA降解規(guī)律以推斷PMI。

作為快速高效的RNA定量技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在PMI推斷的研究中得到廣泛應(yīng)用。為了保證結(jié)果的可重復(fù)性和客觀性，在應(yīng)用該技術(shù)時(shí)應(yīng)對(duì)各項(xiàng)操作進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范。Bustin等［6］提出的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR指南（the minimum information for publication of qRT-PCR experiments，MIQE）正逐漸被廣泛認(rèn)可。本實(shí)驗(yàn)流程均按照MIQE指南進(jìn)行，包括樣本的采集、處理和準(zhǔn)備，RNA的質(zhì)量控制、反轉(zhuǎn)錄效率、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增曲線、溶解曲線檢測靈敏性、特異性、內(nèi)參指標(biāo)的選擇、數(shù)據(jù)處理等。其中，定量PCR結(jié)果很大程度上依賴于內(nèi)參指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化處理［6-8］。因此，篩選出穩(wěn)定適用、較少受PMI和溫度影響的內(nèi)參指標(biāo)就顯得尤為必要。

經(jīng)geNorm軟件統(tǒng)計(jì)后，5S rRNA、miR-9和miR-125b在4個(gè)溫度組中都比較穩(wěn)定，因此將這3種指標(biāo)作為本研究的內(nèi)參指標(biāo)，其余指標(biāo)作為候選指標(biāo)。5S rRNA在miRNA研究中常被選作內(nèi)參基因［9-10］，其存在于核糖體蛋白復(fù)合物中，可適度隔絕核酶和其他因素的影響，使之保持穩(wěn)定。相對(duì)于18S rRNA，5S rRNA片段較短，受PMI及溫度因素的影響較小，更適合作為PMI推斷的內(nèi)參指標(biāo)。miRNA屬于非編碼小RNA家族，其長度只有21～25 bp，以往研究［11-13］證實(shí)，miRNA在死后一段時(shí)間內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定。在不同溫度組中，miR-9 和miR-125b在死后24h內(nèi)均保持穩(wěn)定，表明miRNA適合作為PMI推斷的內(nèi)參指標(biāo)。此外miR-9和miR-125b均是腦組織特異性miRNA［14］。β-actin和GAPDH是常用的RNA指標(biāo)，性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定保守［15］。本課題組在前期研究中也常選用β-actin和GAPDH作為候選指標(biāo)進(jìn)行PMI推斷［11-12，16］。U6 snRNA在PMI相關(guān)研究中也常被選作內(nèi)參指標(biāo)［7，11］，張萍等［17］證實(shí)死亡早期人體心肌組織中U6 snRNA表達(dá)穩(wěn)定，其穩(wěn)定性可能與其本身的發(fā)卡結(jié)構(gòu)及存在的細(xì)胞核中沒有核酶有關(guān)。本研究腦組織中U6 snRNA在溫度較低時(shí)表達(dá)穩(wěn)定，但在溫度較高（尤其是35℃組）時(shí)穩(wěn)定性降低，即U6 snRNA穩(wěn)定性與溫度有關(guān)，不適合作為本研究內(nèi)參指標(biāo)，這可能是由于通常狀態(tài)下與snRNA結(jié)合成復(fù)合物的小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNP）在較高溫度時(shí)降解所致［18］。RPS29和18S rRNA也是檢測PMI的常用指標(biāo)，降解規(guī)律在不同實(shí)驗(yàn)條件下呈現(xiàn)出不同的模式［5，11-12］，還需進(jìn)一步研究。

對(duì)上述5種候選RNA指標(biāo)進(jìn)行內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理，在各溫度組分別對(duì)ΔCt值和PMI進(jìn)行回歸分析，并依據(jù)相關(guān)系數(shù)篩選出與PMI相關(guān)性最好的RNA指標(biāo)。結(jié)果表明，β-actin、GAPDH在不同條件下均具有較高的相關(guān)系數(shù)。內(nèi)參選擇時(shí)也印證了這一點(diǎn)，即β-actin和GAPDH在4個(gè)溫度組中都具有較高的M值。相較其他候選RNA指標(biāo)，β-actin和GAPDH更容易受到PMI的影響，在24h內(nèi)隨PMI延長不斷降解，擁有良好的時(shí)序性降解規(guī)律，與一些前期研究［11-12，19］一致?？紤]到環(huán)境溫度的影響，為了使PMI推斷結(jié)果更加精確，本研究使用R軟件分別對(duì)β-actin和GAPDH進(jìn)行多參數(shù)擬合，得到ΔCt值、溫度和PMI三個(gè)變量的三元二次方程，決定系數(shù)R2分別為0.9375和0.9017，表明擬合優(yōu)度較高。說明在不同溫度下，β-actin和GAPDH有著相似的降解規(guī)律，ΔCt值與PMI的關(guān)系近似符合三元二次方程分布。在24 h內(nèi)，β-actin和GAPDH的ΔCt值隨著PMI延長不斷增加，表明RNA 隨PMI不斷降解。溫度較低時(shí)ΔCt值增加速率較慢，而溫度較高時(shí)ΔCt值增加速率較快，表明ΔCt值升高速率與環(huán)境溫度也呈正相關(guān)關(guān)系，證實(shí)隨著環(huán)境溫度的增高，RNA的降解速率加快。

為確保PMI推斷的準(zhǔn)確性，本研究還利用已知PMI的備用大鼠樣本對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證。運(yùn)用βactin模型進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，實(shí)際PMI為10h的樣本，推斷誤差在2.3 h內(nèi)；實(shí)際PMI為20 h的樣本，推斷誤差在3.6h內(nèi)。運(yùn)用GAPDH模型進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，實(shí)際PMI 為10h的樣本，推斷誤差在3.9h內(nèi)；實(shí)際PMI為20h的樣本，推斷誤差在5.5h內(nèi)。相較GAPDH，利用βactin模型進(jìn)行PMI推斷更為精確，這可能是由于βactin模型擁有更高的決定系數(shù)，擬合優(yōu)度較好。環(huán)境溫度越高、PMI越長，利用該模型推斷PMI的精確性越高，推測是由于隨PMI的延長和環(huán)境溫度增高，RNA降解速率加快以致ΔCt增加明顯所致。

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)觀察大鼠腦組織8種RNA指標(biāo)在5℃、15℃、25℃和35℃環(huán)境中的早期降解規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在4個(gè)溫度組中，5S rRNA、miR-9和miR-125b表達(dá)穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參指標(biāo)。經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化處理后β-actin和GAPDH與PMI和環(huán)境溫度有著較好的相關(guān)性，表明RNA降解不僅與PMI有關(guān)，也與環(huán)境溫度有關(guān)。經(jīng)R軟件擬合ΔCt值、溫度和PMI三個(gè)變量，分別得到β-actin和GAPDH的數(shù)學(xué)模型推斷PMI。用已知PMI的大鼠樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)運(yùn)用該數(shù)學(xué)模型推斷早期PMI相對(duì)準(zhǔn)確有效，有望成為早期PMI推斷的新方法。在今后的研究中，本課題組將對(duì)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步使用人體資料進(jìn)行驗(yàn)證。

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（本文編輯：鄒冬華）

中圖分類號(hào)：DF795.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.002

文章編號(hào)：1004-5619（2016）03-0165-06

基金項(xiàng)目：上海健康醫(yī)學(xué)院種子基金項(xiàng)目；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃項(xiàng)目

作者簡介：呂葉輝（1989—），男，碩士，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)、科研工作；E-mail：yeyeliushu@163.com

通信作者：陳龍，男，博士，主任法醫(yī)師，副教授，主要從事法醫(yī)病理學(xué)及法醫(yī)臨床學(xué)研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cnPCR技術(shù)，檢測死后24h內(nèi)大鼠腦組織8種RNA在5℃、15℃、25℃和35℃環(huán)境下的變化規(guī)律，建立各指標(biāo)與PMI之間的關(guān)系模型，以期為不同溫度下早期PMI的推斷提供新思路。

收稿日期：（2016-01-30）

Correlation between RNA Degradation Patterns of Rat’s Brain and Early PMI at Different Temperatures

Lü Ye-hui1，LI Zhi-hong1，TUO Ya1，LIU Li1，LI Kun1，BIAN Jie1，MA Jian-long2，CHEN Long2
（1.School of Basic Medical Science，Shanghai University of Medicine&Health Science，Shanghai 201318，China；2.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Science，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Abstract：Objective To explore the correlation between early postmortem interval（PMI）and eight RNA markers of rat’s brain at different temperatures.Methods Total 222 SD rats were randomly divided into control group（PMI=0 h）and four experimental groups.And the rats in the experimental groups were sacrificed by cervical dislocation and respectively kept at 5℃，15℃，25℃ and 35℃ in a controlled environment chamber.The RNA was extracted from brain tissues，which was taken at 9 time points from 1 h to 24 h postmortem.The expression levels of eight markers，β-actin，GAPDH，RPS29，18S rRNA，5S rRNA，U6 snRNA，miRNA-9 and miRNA-125b，were detected using real-time fluorescent quantitative PCR，respectively.Proper internal reference was selected by geNorm software.Regression analysis of normalized RNA markers was performed by SPSS software.Mathematical model for PMI estimation was established using R software.Another 6 SD rats with known PMI were used to verify the mathematical model.Results 5S rRNA，miR-9 and miR-125b were suitable as internal reference markers for their stable expression.Both β-actin and GAPDH had well time-dependent degradation patterns and degraded continually with prolongation of PMI in 24 h postmortem.The mathematical model of the variation of ΔCt values with PMI and temperature was set up by R software and the model could be used for PMI estimation.The average error rates of model validation using β-actin and GAPDH were 14.1%and 22.2%，respectively.Conclusion The expression levels of β-actin and GAPDH are well correlated with PMI and environmental temperature.The mathematical model established in present study can provide references for estimating early PMI under various temperature conditions.

Key words：forensic pathology；RNA；postmortem intervals；temperature；degradation；rats