劉立民，侯雄軍，湯韶明，甘曉云，劉　玲，張五萍

(江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

?

HPLC法測(cè)定桉芩止咳糖漿中黃芩苷及其不確定度評(píng)定

劉立民，侯雄軍，湯韶明，甘曉云，劉玲，張五萍

(江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

[摘要]目的建立桉芩止咳糖漿中黃芩苷的HPLC測(cè)定方法，并對(duì)所建立方法進(jìn)行不確定度評(píng)定。方法采用HPLC法測(cè)定桉芩止咳糖漿中黃芩苷的含量，再根據(jù)方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)，對(duì)測(cè)定過(guò)程中引入的不確定度進(jìn)行評(píng)定，并計(jì)算合成不確定度，最終計(jì)算出測(cè)量結(jié)果在95%置信區(qū)間下的擴(kuò)展不確定度。結(jié)果采用本方法測(cè)定桉芩止咳糖漿中黃芩苷含量的擴(kuò)展不確定度為2.16%。結(jié)論綜合不確定度評(píng)定，可使測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠，可用于桉芩止咳糖漿的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]桉芩止咳糖漿；黃芩苷；不確定度；高效液相色譜法

桉芩止咳糖漿為我院治療因外感風(fēng)熱、熱郁肺經(jīng)、肺失宣肅所致的咳嗽、咳痰、痰黃或白、喘息等疾病的醫(yī)院制劑，由桉葉、黃芩、枇杷葉、麻黃、百部、桔梗六味中藥組成。方中黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主要含黃芩苷、黃芩素等黃酮類化合物，是桉芩止咳糖漿發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1-3]。

測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)。由于結(jié)果測(cè)量定量表征是通過(guò)測(cè)量不確定度進(jìn)行的，中國(guó)合格評(píng)定認(rèn)可委員會(huì)(CNAL)對(duì)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可時(shí)候均需開展對(duì)測(cè)量不確定度的評(píng)定[4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)所建立的含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證的同時(shí)，根據(jù)中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)頒布的《分析測(cè)量中不確定度的評(píng)定》[5]，并參考文獻(xiàn)[6-8]定量測(cè)定不確定度評(píng)定方法，對(duì)桉芩止咳糖漿中黃芩苷的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定研究，建立了一套合理、完善的桉葉止咳糖漿的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

1儀器與試藥

島津LC-2010A高效液相色譜儀； Diamonsil C18色譜柱(250x4.6mm，5 μm)；KQ118超聲波清洗器；ACS型電子計(jì)價(jià)天平；AE240萬(wàn)分之一電子分析天平；Sartorius BP211D十萬(wàn)分之一電子分析天平。

黃芩苷(批號(hào)：110715-200514，供含測(cè)用，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；實(shí)驗(yàn)所用藥材購(gòu)自江西江中武寧中藥有限公司。乙腈(色譜純，西隴化工股份有限公司)、甲醇(色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)、二級(jí)純化水(本院制劑室提供)，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1黃芩苷的含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備稱取干燥恒重過(guò)的黃芩苷對(duì)照品0.004 12 g，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得0.4120 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液，然后將其稀釋成濃度為0.309 0，0.206 0，0.103 0，0.051 5，0.025 8，0.012 9，0.006 4 mg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備精密量取桉芩止咳糖漿10 mL，用純化水稀釋至200 mL，超聲，混勻。取稀釋液1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，超聲，混勻，取稀釋液適量，用0.45 μm微孔濾頭過(guò)濾，即得。

2.1.3陰性對(duì)照溶液的制備取處方中缺黃芩藥材的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得缺黃芩陰性對(duì)照供試品溶液。

2.1.4色譜條件色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水=23∶77；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.5系統(tǒng)適用性試驗(yàn)取黃芩苷對(duì)照品溶液，供試品溶液，陰性對(duì)照溶液，注入HPLC色譜儀，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果供試品溶液中黃芩苷得到很好的分離，峰型對(duì)稱性較好，且陰性無(wú)干擾，理論塔板數(shù)以黃芩苷計(jì)大于2 500，表明此條件適用于供試品中黃芩苷的檢測(cè)，見圖1。

A：黃芩苷對(duì)照品溶液(0.103 0 mg/mL)；B：供試品溶液；C：缺黃芩陰性對(duì)照?qǐng)D1　黃芩苷HPLC圖

2.1.6線性關(guān)系考察精密吸取稀釋好的黃芩苷對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以黃芩苷濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程：y=31 335 371.8x+36 068.5(R2=1.000 0，n=8)，表明黃芩苷濃度在0.006 4～0.412 0 mg/mL之間具有很好的線性關(guān)系。

2.1.7方法學(xué)考察

2.1.7.1精密度試驗(yàn)精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得黃芩苷平均峰面積為3 299 547，RSD為0.26%，表明儀器精密度較高。

2.1.7.2穩(wěn)定性試驗(yàn)按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0,1,2,4,8,12 h各進(jìn)樣一次，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得黃芩苷平均峰面積為3 820 700，RSD為0.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.7.3重復(fù)性試驗(yàn)按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得黃芩苷平均峰面積為3 804 035，RSD為1.53%，表明該法重現(xiàn)性較好。

2.1.7.4加樣回收率試驗(yàn) 精密移取同一批桉芩止咳糖漿(黃芩苷含量為24.371 2 mg/mL)，6份，每份10 mL，用純化水稀釋至200 mL，超聲，混勻。取稀釋液1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，精密加入濃度為1.214 0 mg/mL黃芩苷對(duì)照品溶液1.0 mL，用70%乙醇稀釋至刻度，超聲，混勻，取稀釋液適量，用0.45 μm微孔濾頭過(guò)濾，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為98.41，RSD為1.81%，表明該法回收率較高。見表1。

表1　黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2不確定度評(píng)價(jià)

2.2.1不確定來(lái)源分析本實(shí)驗(yàn)中不確定度的主要來(lái)源為測(cè)量過(guò)程中的對(duì)照品和樣品的體積引入不確定度、質(zhì)量不確定度、樣品回收率所導(dǎo)致的不確定度以及液相測(cè)試過(guò)程中隨機(jī)效應(yīng)所帶來(lái)的不確定度。因此，可采用重復(fù)性研究數(shù)據(jù)以及實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的回收率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將涵蓋所有樣品制備與檢測(cè)過(guò)程中的隨機(jī)效應(yīng)以及儀器操作、樣品基質(zhì)等因素的系統(tǒng)誤差所引起的不確定度進(jìn)行評(píng)定。

2.2.2不確定度分量量化

表2　標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)不確定度

表3　準(zhǔn)確度的不確定度評(píng)定

2.2.2.4擴(kuò)展不確定度及報(bào)告不確定度95%置信概率下取包含因子κ=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度U95(W)=κ×Ucrel(W)=2×0.010 8=2.16%。實(shí)驗(yàn)所測(cè)批號(hào)140915桉芩止咳糖漿的黃芩苷含量W=24.13 mg/mL，故其擴(kuò)展不確定度為：U95=24.13×0.021 6=0.521 3 mg/mL，其他批次的擴(kuò)展不確定度見表4。

3討論

本實(shí)驗(yàn)以桉芩止咳糖漿為研究對(duì)象，建立其有效成分黃芩苷的定量測(cè)定方法，根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定，方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容有準(zhǔn)確度、精密度等，但這些試驗(yàn)并未對(duì)實(shí)驗(yàn)具體測(cè)定結(jié)果的可信度進(jìn)行量化。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)不確定度理論對(duì)方法的重復(fù)性及回收率試驗(yàn)進(jìn)行不確定度評(píng)定，并在 95%的置信區(qū)間下，得出本方法所測(cè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為(W×2.16%)mg/mL，定量描述實(shí)驗(yàn)方法的可信度，可作為桉芩止咳糖漿中黃芩苷定量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證的一種補(bǔ)充。

表4　桉芩止咳糖漿中黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果(n=3,mg/mL)

在藥物分析檢測(cè)評(píng)定不確定度時(shí)，應(yīng)盡可能地分析產(chǎn)生不確定度的所有可能來(lái)源。目前，分析測(cè)試領(lǐng)域中多采用對(duì)每個(gè)測(cè)定步驟進(jìn)行分析，從而得出對(duì)測(cè)定結(jié)果的不確定度。但是由于化學(xué)分析操作相對(duì)較為復(fù)雜，需附加實(shí)驗(yàn)后再進(jìn)行B類不確定度的評(píng)定，而且其測(cè)定過(guò)程中對(duì)A類不確定度也較難評(píng)定，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法學(xué)驗(yàn)證法(Validation-based法)的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)定，通過(guò)采用方法學(xué)考察的準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)行整體考察檢測(cè)方法的不確定度，此法適合于中藥分析中的實(shí)際應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S]. 北京：中醫(yī)藥科技出版社,2010:282-283

[2]李彤彤,李宏,侯茂君,等. 黃芩化學(xué)成分及黃芩苷提取方法研究進(jìn)展[J]. 天津藥學(xué),2002,14(3):7

[3]延衛(wèi)東,王瑞君,何琰,等. 黃芩苷藥理作用研究進(jìn)展[J]. 陜西中醫(yī),2002,23(12):1127-1129

[4]ISO/IEC 17025:2005,General requirements for the competence of calibration and testing laboratories[S]. Geneve,2005:9

[5]中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[M]. 北京: 中國(guó)計(jì)量出版社,2002

[6]魏惠珍,謝菲,饒毅,等. HPLC 法測(cè)定元胡止痛膠囊中延胡索乙素及其不確定度評(píng)定[J]. 中草藥，2012,43(2):299-302

[7]饒毅,夏川川,周海濱,等. 高效液相色譜法測(cè)定白芍總苷的不確定度分析[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011,17(19):89-93

[8]Dabalus IM,Schweikert TM,Cannavan A. Comparison of methods for the estimation of measurement uncertainty for an analytical method for sulphonamides[J]. Food Addit Contam,2008,25(12):1439-1450

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.036

[中圖分類號(hào)]R965.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)19-2152-03

[通信作者]侯雄軍，E-mail：66928053@qq.com

[基金項(xiàng)目]江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金項(xiàng)目(2013A047)

[收稿日期]2016-02-15