陸　瑩，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230061)

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新藤黃酸誘導(dǎo)黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制研究

陸瑩，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230061)

[摘要]目的探討新藤黃酸誘導(dǎo)黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制。方法MTT試驗(yàn)檢測(cè)新藤黃酸對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的抑制作用;倒置顯微鏡觀察黑色素瘤B16細(xì)胞在新藤黃酸作用下產(chǎn)生的形態(tài)變化；透射電鏡觀察新藤黃酸對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)新藤黃酸誘導(dǎo)黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體膜電位及ROS的改變；Western blot 法檢測(cè)LC-3、mTOR、AMPK及SIRT3等自噬相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果MTT結(jié)果顯示新藤黃酸在體外對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖有明顯抑制作用，且隨著新藤黃酸濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力明顯下降；倒置顯微鏡觀察黑色素瘤B16細(xì)胞顯示隨著新藤黃酸濃度增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細(xì)胞死亡增多；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)新藤黃酸作用黑色素瘤B16細(xì)胞后，細(xì)胞發(fā)生明顯的線粒體自噬的形態(tài)學(xué)變化；Western blot法檢測(cè)表明隨著新藤黃酸給藥時(shí)間的延長(zhǎng)， AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量呈時(shí)間依賴性上升，LC3-I蛋白表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下降，mTOR蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)有所下降。結(jié)論新藤黃酸在一定時(shí)間和濃度范圍內(nèi)能夠抑制黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬，其誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體自噬的機(jī)制可能與調(diào)控ROS/SIRT3/AMPK信號(hào)通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]新藤黃酸;黑色素瘤；B16細(xì)胞；線粒體自噬;分子機(jī)制

皮膚黑色素瘤是一種源于黑色素細(xì)胞且惡性程度極高的腫瘤，屬于皮膚癌的一種，因其具有易轉(zhuǎn)移，對(duì)傳統(tǒng)放、化療均不敏感等特性及近年發(fā)病率呈逐年增高和相對(duì)年輕化趨勢(shì)，使其成為現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外皮膚腫瘤研究的熱點(diǎn)[1-2]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)黑色素瘤治療效果良好的藥物。藤黃是藤黃科植物藤黃樹所分泌出來(lái)的干燥樹脂，古醫(yī)書中記載其具有解毒、抗炎和驅(qū)蟲等生物學(xué)功能[3]，在現(xiàn)代中醫(yī)臨床中被廣泛應(yīng)用于治療癌癥、瘡瘍、毛囊炎等[4]。呂歸寶等[5]于1984年分離得到一種分子結(jié)構(gòu)與藤黃酸相類似的化合物，命名為新藤黃酸。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果初步表明，新藤黃酸能夠選擇性抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且與藤黃酸相比，其毒性較低，而抗腫瘤活性更加廣泛。然而，目前人們對(duì)新藤黃酸的抗腫瘤作用機(jī)制還不十分清楚。本研究觀察了新藤黃酸在體外抗黑色素瘤B16細(xì)胞的作用，并對(duì)其抗癌機(jī)制進(jìn)行了初步探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1藥物及實(shí)驗(yàn)試劑新藤黃酸(粉針，純度≥99%，亮黃色結(jié)晶體)由安徽中醫(yī)藥大學(xué)王效山教授提供。新藤黃酸加入適量DMSO中，使其充分溶解，再用 RPMI-1640培養(yǎng)液將其稀釋成100 mmol/L的母液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存時(shí)間不超過(guò)2周。RPMI-1640(Gibco公司)，胎牛血清(Thermo Fisher scientific公司)，胰蛋白酶(Amersco公司)，MTT(Amersco進(jìn)口分裝，武漢生命技術(shù)有限公司)，JC-1(Bestbio公司)，PBS(北京中杉生物技術(shù)有限公司)，BSA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，Western及IP細(xì)胞裂解液(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)，PMSF(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2細(xì)胞株黑色素瘤B16細(xì)胞來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3主要儀器超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)，Hi-tachi-600透射電子顯微鏡(日本日立)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry，美國(guó)Becton Dickinson公司)。

1.4方法

1.4.1MTT試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素瘤B16細(xì)胞消化收集，將細(xì)胞密度調(diào)整為6×104mL-1并接種于無(wú)菌的96孔板中，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照組。接種后培養(yǎng)過(guò)夜，在倒置顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞貼壁良好，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的新藤黃酸溶液(0，0.75，1.5，3.0，6.0 μmol/L)，細(xì)胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24，48，72 h。于結(jié)束培養(yǎng)前4 h小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔再加入DMSO 150 μL，振蕩10 min混勻。570 nm波長(zhǎng)下用Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔光密度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并按照下列公式計(jì)算：細(xì)胞增殖抑制率(%)=(陰性對(duì)照OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/陰性對(duì)照OD值×100%。改良寇式法：lgIC50=Xm-I×[P-(3-Pm-Pn )/4][Xm為lg(最大劑量)；I為lg(最大劑量/相鄰劑量)；P為陽(yáng)性反應(yīng)率之和；Pm為最大陽(yáng)性反應(yīng)率；Pn為最小陽(yáng)性反應(yīng)率]。

1.4.2倒置顯微鏡觀察黑色素瘤B16細(xì)胞形態(tài)變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素瘤B16細(xì)胞消化收集，調(diào)整為4×104mL-1濃度的細(xì)胞懸液接種于無(wú)菌6孔板中，每孔加入2 mL。接種后培養(yǎng)過(guò)夜，確認(rèn)貼壁良好后按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的新藤黃酸溶液(0，1.5，3.0 μmol/L)，處理24 h后置于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.4.3透射電鏡觀察黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體自噬情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素瘤B16細(xì)胞消化收集，接種于無(wú)菌6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后分別加入1.5，3.0 μmol/L新藤黃酸溶液處理24 h，空白對(duì)照組加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。胰酶消化后離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗2遍，4 ℃環(huán)境下用2.5%戊二醛將細(xì)胞團(tuán)塊固定12 h以上，制備超薄切片，經(jīng)枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察并攝片。

1.4.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體膜電位消化收集分別用0，1.5，3.0，6.0 μmol/L新藤黃酸溶液處理24 h的黑色素瘤B16細(xì)胞，加入終濃度為5 μg/L的JC-1染液，于37 ℃、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育10 min，800 r/min低速離心5 min，棄去上清液，用RMPI-1640培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，再于37 ℃、 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)488～505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～575 nm)。

1.4.5Western blot檢測(cè)黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白變化將黑色素瘤B16細(xì)胞用3.0 μmol/L新藤黃酸溶液分別處理0,6,12,24 h后提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。10%～15%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉封閉，4 ℃一抗孵育過(guò)夜。PBST洗滌3次，每次10 min。再加HRP標(biāo)記的二抗稀釋液室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次10 min。ECL試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片。

2結(jié)果

2.1黑色素瘤B16細(xì)胞增殖抑制率黑色素瘤B16細(xì)胞增殖抑制率隨新藤黃酸濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　不同濃度新藤黃酸作用不同時(shí)間黑色素瘤B16細(xì)胞增殖抑制率

2.2黑色素瘤B16細(xì)胞形態(tài)變化倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未加新藤黃酸處理的黑色素瘤B16細(xì)胞數(shù)目較多,細(xì)胞伸展良好,胞質(zhì)均勻透明；1.5 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細(xì)胞24 h后，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞固縮變圓，體積變小，少量細(xì)胞貼壁不牢，呈半貼壁狀態(tài)；3.0 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細(xì)胞24 h后可觀察到多數(shù)細(xì)胞固縮變圓，脫落，漂浮于培養(yǎng)液中，少數(shù)細(xì)胞體積增大、腫脹、破裂呈壞死狀。見(jiàn)圖2～4。

圖2　未經(jīng)新藤黃酸處理黑色素瘤B16細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(×200)

圖3　1.5 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(×200)

圖4　3.0 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)(×200)

2.3黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體自噬情況透射電鏡下可見(jiàn)未經(jīng)新藤黃酸處理的黑色素瘤B16細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰,基本沒(méi)有自噬線粒體形成；1.5 μmol/L新藤黃酸處理24 h后的黑色素瘤B16細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量線粒體出現(xiàn)腫脹及空泡結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)脊斷裂，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均接近于正常，只出現(xiàn)少量自噬線粒體；3 μmol/L新藤黃酸處理24 h后的黑色素瘤B16細(xì)胞可見(jiàn)核內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)大量自噬線粒體，線粒體結(jié)構(gòu)紊亂且多空泡化，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬空泡聚集，部分空泡內(nèi)可見(jiàn)內(nèi)容物，并有部分線粒體被包裹進(jìn)囊泡。見(jiàn)圖5～7。

2.4黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體膜電位流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的新藤黃酸溶液作用黑色素瘤B16細(xì)胞24 h后，線粒體膜電位水平隨新藤黃酸濃度的增加而逐漸下降，其中6 μmol/L新藤黃酸作用24 h后，線粒體膜電位下降非常明顯。見(jiàn)圖8～11。

2.5黑色素瘤B16細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況3 μmol/L新藤黃酸作用黑色素瘤B16細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，AMPK、SIRT3 及LC3-II蛋白表達(dá)量呈時(shí)間依賴性上升，LC3-I蛋白表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下降，mTOR蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)有所下降。見(jiàn)圖12。

圖5　未經(jīng)新藤黃酸處理24 h后細(xì)胞線粒體自噬現(xiàn)象(×20 000)

圖6　1.5 μmol/L新藤黃酸處理24 h后細(xì)胞線粒體自噬現(xiàn)象(×20 000)

圖7　3.0 μmol/L新藤黃酸處理24 h后細(xì)胞線粒體自噬現(xiàn)象(×20 000)

圖8　未經(jīng)新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體膜電位

圖9　1.5 μmol/L新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體膜電位

圖10　3.0 μmol/L新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體膜電位

圖11　6.0 μmol/L新藤黃酸處理24 h后黑色素瘤B16細(xì)胞線粒體膜電位

圖12　黑色素瘤B16細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前惡性腫瘤已成為人類死亡原因的第一位，而黑色素瘤作為一種惡性皮膚瘤，因其易轉(zhuǎn)移及對(duì)放化療不敏感等特性，已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。細(xì)胞線粒體自噬是發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的一種選擇性的自噬過(guò)程，最早由Lematsters于2005年提出，主要指在活性氧(ROS)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞衰老等刺激下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化損傷，而損傷的線粒體又被特異性地包裹進(jìn)自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成線粒體損傷的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

SIRT3是NAD+依賴的第Ⅲ類組蛋白去乙?；傅某蓡T,這個(gè)家族簡(jiǎn)稱sirtuins(SIRTS)，在整個(gè)SIRTS家族中,SIRT3作為線粒體去乙酰酶,對(duì)抗衰老和癌癥發(fā)生的作用較明顯,但是其作用機(jī)制還尚不明確,可能與線粒體內(nèi)ROS水平相關(guān)，SIRT3可上調(diào)AMPK磷酸化水平，而 SIRT3H248Y對(duì)其磷酸化無(wú)影響，說(shuō)明SIRT3激活A(yù)MPK磷酸化依賴于其去

乙?；饔肹6]。目前，AMPK在癌癥中的作用已經(jīng)受到眾多研究者的廣泛關(guān)注，其在正常組織中具有抑制腫瘤細(xì)胞形成的作用，而在體外，AMPK也被證明對(duì)多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞株如肺癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌[7-9]具有毒性作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在SIRT3缺失的小鼠生殖細(xì)胞系中，線粒體ROS的水平有所上調(diào)，而在SIRT3表達(dá)的細(xì)胞中ROS水平被抑制[10]。以上均表明SIRT3在線粒體中發(fā)揮作用，其缺失能夠引起異常的線粒體代謝和細(xì)胞損傷，與惡性腫瘤的發(fā)生具有某種潛在聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，新藤黃酸在體外對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖有明顯抑制作用，且隨著新藤黃酸濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力明顯下降；隨著新藤黃酸濃度增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細(xì)胞死亡增多，細(xì)胞發(fā)生明顯線粒體自噬的形態(tài)學(xué)變化；隨著新藤黃酸給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，AMPK、SIRT3及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量呈時(shí)間依賴性上升，LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量呈時(shí)間依賴性下降，mTOR蛋白表達(dá)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)有所下降。提示新藤黃酸能夠在一定時(shí)間和濃度范圍內(nèi)抑制黑色素瘤B16細(xì)胞中ROS/SIRT3/AMPK這一信號(hào)傳導(dǎo)通路的過(guò)度活化，誘導(dǎo)黑色素瘤B16細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬。

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Study on the mechanism of mitochondrial autophagy in melanoma B16 cell induced by Gambogenic acid

LU Ying, LI Qinglin

(Anhui University of Traditional Chinese Medicine, Hefei 230061, Anhui, China)

Abstract:Objective It is to explore the mechanism of mitochondrial autophagy in melanoma B16 cell induced by Gambogenic acid. Methods MTT experiment was used to detect the inhibition of Gambogenic acid on proliferation of melanoma B16 cell. The morphology changes of the cells were observed under inverted microscope. The effect of Gambogenic acid on the mitochondrial ultrastructure was observed by transmission electron microscopy. Membrane potential and ROS changes in mitochondria were detected by flow cytometry.The correlated protein of mitochondrial autophagy such as LC-3, mTOR, AMPK and SIRT3 were detected by Western blot method. Results MTT results showed that Gambogenic acid has inhibition on the growth and proliferation of B16 cells, with the increase of concentration and time, the activity of the cells get lower and lower. The results under inverted microscope showed that with the concentration increase, the cell structure was damaged more obviously with more death cells. The results under transmission electron microscopy showed than the obvious morphology changes of B16 cells like mitochondrial autophagy could be found after induce by Gambogenic acid. Western blot method results showed that the expression of AMPK, SIRT3 and LC3-Ⅱ had a time dependence increase and LC3-Ⅰ had a time dependence decrease, that of mTOR decreased a little with time increase. Conclusion Gambogenic acid can inhibit the proliferation of B16 cell in some range of time and dosage, it can induce the mitochondrial autophagy, and the mechanism may be related with its regulation of ROS/SIRT3/AMPK signal pathway.

Key words:Gambogenic acid; melanoma B16 cell; mitochondrial autophagy; molecular mechanism

[作者簡(jiǎn)介]陸瑩，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿铀幚韺W(xué)。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.19.009

[中圖分類號(hào)]R-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)19-2079-04

[收稿日期]2016-01-28