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        黃精地龍方對體外培養(yǎng)分化的SH-SY5Y細(xì)胞Aβ25-35損傷中的保護(hù)作用研究

        2016-07-21 08:21:54肖移生曾元鳳侯吉華
        關(guān)鍵詞:維甲酸黃精神經(jīng)細(xì)胞

        肖移生,曾元鳳,侯吉華,李 青

        (1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西 南昌 330004;2. 江西省人民醫(yī)院,江西 南昌 330006)

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        論著

        黃精地龍方對體外培養(yǎng)分化的SH-SY5Y細(xì)胞Aβ25-35損傷中的保護(hù)作用研究

        肖移生1,曾元鳳2,侯吉華1,李青1

        (1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,江西 南昌 330004;2. 江西省人民醫(yī)院,江西 南昌 330006)

        [摘要]目的探討黃精地龍方(RPEWM) 對體外培養(yǎng)分化的SH-SY5Y細(xì)胞Aβ25-35損傷的影響。方法SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)分化,再經(jīng)Aβ25-35造成細(xì)胞老年癡呆(AD)損傷,觀察不同濃度RPEWM提取液對損傷后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖情況及培養(yǎng)液中MDA、LDH含量,細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性和細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量、Caspase-3酶活性的影響。結(jié)果RPEWM提取液在10~125 mg/L濃度范圍內(nèi)能明顯抗細(xì)胞AD損傷,促進(jìn)細(xì)胞增殖;RPEWM提取液30,60,90 mg/L均能明顯降低MDA、LDH含量及細(xì)胞內(nèi)鈣離子、Caspase-3酶活性,升高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px酶活性,且呈劑量依賴性。結(jié)論RPEWM對分化的SH-SY5Y細(xì)胞Aβ25-35損傷有良好的保護(hù)作用,對AD有一定治療作用。

        [關(guān)鍵詞]黃精地龍方;SH-SY5Y細(xì)胞;Aβ25-35;老年癡呆

        老年癡呆(Alzheimer’s disease,AD) 是嚴(yán)重危害廣大老年人身心健康的常見病、多發(fā)病之一,但至今臨床醫(yī)療尚缺乏特異性、高效性治療藥物,因此從我國中醫(yī)藥中開發(fā)具有腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的藥物具有十分重要的意義。黃精地龍方(Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures,RPEWM)系本課題組依據(jù)中醫(yī)理論自創(chuàng)方,前期研究發(fā)現(xiàn)該方具有明顯抗大鼠及小鼠老年癡呆作用[1-2]。為進(jìn)一步闡述該方對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞是否具有保護(hù)作用,本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞)經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)分化,再經(jīng)Aβ25-35致細(xì)胞AD損傷,探討RPEWM抗神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制。

        1實驗資料

        1.1藥物RPEWM由黃精、地龍兩味中藥按1∶1組成。黃精與地龍均購自江西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房,并經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥生藥教研室鑒定地龍屬于廣地龍、黃精屬于多花黃精,且均符合國家中藥臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。人參皂甙Rb1標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所 (純度≥99.9%)。RPEWM濃縮提取液制備[3]:將黃精100 g、地龍100 g用超微粉碎機(jī)粉碎后,常溫下將黃精、地龍粉以1∶1比例混合,加1 000 mL蒸餾水浸漬,不時攪拌使其充分浸泡12h;沸水回流2h,濾過,收集提取液,向粗濾后的殘渣內(nèi)再加1 000 mL蒸餾水(100 ℃),并再次沸水回流1 h,濾過,收集提取液;合并2次提取液后離心(2 000 r/min,20 min),收集上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮形成200 mL濃縮液(每1 mL相當(dāng)含生藥1 g)為實驗用的RPEWM濃縮提取液,過濾除菌,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2試劑胎牛血清及DMEM/F12培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 檢測試劑盒均為福建邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、全反式維甲酸、Aβ25-35、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Fura-2/Am 均為Sigma公司產(chǎn)品;鈣離子濃度校正試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品;Caspase-3檢測試劑盒為Biovision公司產(chǎn)品;其余試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。

        1.3儀器752分光光度計為上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品,多功能熱回流中藥提取濃縮機(jī)為上海定泰蒸發(fā)器有限公司產(chǎn)品,熒光分光光度計及酶標(biāo)儀為美國THERMO FISHER公司產(chǎn)品,其他均為常用儀器。

        1.4SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞(庫)中心,以5.0×104mL-1細(xì)胞濃度置于含15%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液中培養(yǎng),用于后續(xù)實驗。

        1.5AD細(xì)胞模型建立參照文獻(xiàn)[4-5]方法,SH-SY5Y細(xì)胞接種培養(yǎng)24 h后,加入終濃度為1 μmol/L的全反式維甲酸處理細(xì)胞3 d來誘導(dǎo)其分化,再加入10 μmol/L的Aβ25-35作用細(xì)胞48 h,建立AD細(xì)胞模型。

        1.6細(xì)胞增殖率測定采用MTT法測定。細(xì)胞置于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng),經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)分化后,分成正常組、損傷組、人參皂甙組、RPEWM提取液組(包括9個濃度組)。RPEWM提取液組加入Aβ25-35處理的同時,分別加入1,5,10,25,50,75,100,125,150 mg/L的RPEWM提取液保護(hù),繼續(xù)培養(yǎng)48 h后行MTT法檢測,以尋找藥物的有效濃度范圍,得出量效關(guān)系;人參皂甙組加入Aβ25-35處理的同時加入人參皂甙Rb1(終濃度為50 mg/L) 保護(hù);損傷組只加入Aβ25-35處理;正常組經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)分化后不加Aβ25-35,也不加藥物保護(hù)。每組細(xì)胞10個復(fù)孔,且實驗重復(fù)10次。到時間點后,各孔加入MTT液20 μL/孔,4h后終止培養(yǎng),棄去上清,加入DMSO(100 μL/孔),振蕩使結(jié)晶物溶解,用自動酶標(biāo)儀波長570 nm處測吸光度值(D570),以D值高低表示細(xì)胞活力的高低。

        1.7MDA、LDH含量及SOD、GSH-Px活性測定細(xì)胞置于24孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞分化好后,分成正常組、損傷組、人參皂甙組、RPEWM 30 mg/L組、RPEWM 60 mg/L組、RPEWM 90 mg/L組(根據(jù)MTT檢測結(jié)果得出RPEWM提取液的有效濃度范圍分組),培養(yǎng)方法同1.6。到時間點后,收集各組各孔內(nèi)的培養(yǎng)液,定量取部分培養(yǎng)液按試劑盒說明書操作進(jìn)行MDA、LDH含量測定。細(xì)胞用PBS漂洗2遍,每孔加入含0.05 mmol/L EDTA的PBS 200 μL(pH 8.0),再加入1%的Triton-X100 100 μL,將培養(yǎng)板置于振蕩器振蕩2 min使細(xì)胞裂解并溶解,然后加入25% H3PO4100 μL以沉淀蛋白,低溫離心(10 000 r/min)30 min,取沉淀物按說明書測定SOD、GSH-Px活性。蛋白質(zhì)定量用Lowry法。

        1.8細(xì)胞內(nèi)游離鈣([Ca2+]i)含量、Caspase-3酶活性測定 用20 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞,其余過程及實驗分組同SOD、LDH、MDA、GSH-Px測定實驗。到時間點后,收集各組細(xì)胞分別制備成1×109mL-1的細(xì)胞懸液。

        1.8.1[Ca2+]i含量測定各組分別取100 μL細(xì)胞懸液置于96孔培養(yǎng)板內(nèi),加入終濃度為2 μmol/L的Fura-2/Am,于37 ℃恒溫振蕩40 min;再用熒光分光光度計進(jìn)行熒光測定,游離時Fura-2的激發(fā)波長為340 nm,結(jié)合Fura-2的激發(fā)波長為420 nm,分別測定這兩個波長下的熒光強(qiáng)度,求出其比率(R)。再按公式[Ca2+]i = Kd(R-Rmin)/(Rmax-R) 計算各組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的含量,Kd為224 nmol/L,Rmin為最小熒光值(由懸液內(nèi)加入EDTA后的測量值),Rmax為最大熒光值(由懸液內(nèi)加入1% Triton-X100后的測量值)。

        1.8.2Caspase-3活性測定各組分別取100 μL細(xì)胞懸液置于96孔培養(yǎng)板內(nèi),在每孔中依次加入80 μL檢測緩沖液,10 μL待測樣品蛋白,10 μL AcDEVD-PNA(2 mmol/L),37 ℃孵育4 h,上酶標(biāo)儀于405 nm波長處檢測各組細(xì)胞的Caspase-3活性,詳細(xì)步驟見檢測試劑盒說明書。蛋白質(zhì)定量用Lowry法。

        2結(jié)果

        2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察SH-SY5Y細(xì)胞具有類神經(jīng)細(xì)胞(元) 形態(tài),但突起少、短,不長于胞體。經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)1 d后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,胞體上伸出多突起;3 d后分化為神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)更明顯,突起更多、更長,且有分支,分支之間有相連。分化細(xì)胞經(jīng)Aβ25-35處理48 h后損傷較明顯,細(xì)胞折光性差,胞體變圓,突起回縮,突起間的網(wǎng)狀連結(jié)消失,培養(yǎng)液中有較多漂浮細(xì)胞。RPEWM 1 mg/L及5 mg/L組的細(xì)胞形態(tài)也較差,與損傷組的細(xì)胞形態(tài)相似。10 mg/L以上的RPEWM提取液能減輕細(xì)胞損傷,細(xì)胞生長良好,突起伸展長,漂浮細(xì)胞不明顯,且藥物的保護(hù)作用隨劑量增加越明顯。

        2.2MTT檢測結(jié)果正常組吸光度為0.743±0.041,損傷組為0.333±0.036,人參皂甙組為0.672±0.053,RPEWM 1,5,10,25,50,75,100,125,150 mg/L各組吸光度分別為0.318±0.018,0.366±0.010,0.515±0.044,0.538±0.057,0.642±0.058,0.681±0.049,0.697±0.064,0.725±0.059,0.717±0.060。RPEWM 1 mg/L及5 mg/L組的細(xì)胞增殖率與損傷組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05);RPEWM 10 mg/L以上組的細(xì)胞增殖率均高于損傷組(P均<0.05),且隨劑量增加,細(xì)胞增殖率越高,AD細(xì)胞保護(hù)作用越明顯;RPEWM 125 mg/L組的細(xì)胞增殖率最高,150 mg/L組的細(xì)胞增殖率不再升高,說明此濃度進(jìn)入藥效曲線平臺。故后續(xù)實驗中,將RPEWM提取液濃度設(shè)為30,60,90 mg/L 3個劑量組。

        2.3各組MDA、LDH含量和SOD、GSH-Px活性比較損傷組培養(yǎng)液中MDA、LDH含量均明顯高于正常組(P均<0.05),細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性均明顯低于正常組(P均<0.05)。RPEWM各組培養(yǎng)液中MDA、LDH含量明顯低于損傷組(P均<0.05),細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性明顯高于損傷組(P均<0.05),且呈劑量依賴性。見表1。

        表1 各組MDA、LDH含量和SOD、GSH-Px活性比較

        注:①與正常組比較,P<0.05;②與損傷組比較,P<0.05。

        2.4各組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量、Caspase-3活性比較損傷組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量及Caspase-3活性均明顯高于正常組(P均<0.05);RPEWM各組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量及Caspase-3活性均明顯低于損傷組(P均<0.05),且呈劑量依賴性。見表2。

        表2 各組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i含量、Caspase-3

        注:①與正常組比較,P<0.05;②與損傷組比較,P<0.05。

        3討論

        AD等腦髓病其實質(zhì)是腦神經(jīng)細(xì)胞受到各種損傷因子影響,最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡,從而出現(xiàn)不同的臨床癥狀。已有研究證實Aβ是各種原因誘導(dǎo)AD的共同通路,可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)細(xì)胞死亡;而Aβ25-35是Aβ主要活性片段,其神經(jīng)毒性已被大量研究證實[6]。因此,抗Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷可作為AD治療關(guān)鍵。SH-SY5Y細(xì)胞來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤,其某些生理功能及生物學(xué)特性與正常神經(jīng)元有相似之處,再經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后能分化為神經(jīng)細(xì)胞[4]。

        本研究MTT檢測結(jié)果顯示,10 mg/L以上的RPEWM提取液能提高AD細(xì)胞增殖率,顯示出良好的抗Aβ25-35致神經(jīng)細(xì)胞AD損傷作用,且隨藥物濃度增加,細(xì)胞保護(hù)作用越明顯。當(dāng)RPEWM提取液濃度達(dá)125 mg/L時,其藥效達(dá)到頂峰,由此得出RPEWM提取液抗神經(jīng)細(xì)胞AD損傷的有效劑量范圍在10~125 mg/L。

        各種自由基是損傷體細(xì)胞的重要因子,尤其是氧自由基,能使線粒體膜的多不飽和脂肪酸(PUTA) 過氧化,損傷其結(jié)構(gòu)與功能,引發(fā)能量代謝障礙,最終導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。MDA是PUTA過氧化的分解物,可間接反映自由基對細(xì)胞的損害程度。細(xì)胞內(nèi)有大量的LDH,很少漏出細(xì)胞外,但當(dāng)細(xì)胞受損后,LDH漏出量顯著升高,故檢測細(xì)胞外液中的LDH量可反映細(xì)胞受損程度。SOD是一種自由基清除酶,其活性高低可以反映細(xì)胞對自由基的清除能力。GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化的一種重要酶,它能特異性催化GSH對H2O2的還原反應(yīng),保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整,其活性強(qiáng)弱也可以反映細(xì)胞抗氧化能力的大小。本實驗結(jié)果顯示,Aβ25-35致細(xì)胞AD損傷后培養(yǎng)液中MDA、LDH含量顯著升高,細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性顯著降低;RPEWM各組培養(yǎng)液中MDA、LDH含量顯著降低,細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性顯著升高,且呈劑量依賴性,說明RPEWM能增加細(xì)胞自由基清除能力,抑制脂質(zhì)過氧化,減少單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的氧化分解,從而發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞損傷作用。這與文獻(xiàn)[3-4]結(jié)果相一致,進(jìn)一步證實了RPEWM抗自由基、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)作用的有效性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

        細(xì)胞內(nèi)的鈣離子主要由細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣通道、鈣泵耗能來維持,當(dāng)細(xì)胞受損傷時,線粒體能量代謝障礙,鈣泵不能主動把細(xì)胞內(nèi)的鈣泵出細(xì)胞外;另外,脂質(zhì)過氧化也會促使電壓依賴性鈣通道開放,進(jìn)而鈣離子內(nèi)流,引發(fā)鈣超載[7]。細(xì)胞內(nèi)過量的鈣離子是引發(fā)細(xì)胞凋亡的始動因子之一,啟動核酸內(nèi)切酶,引起凋亡相關(guān)基因表達(dá),最終激活Caspase-3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究中發(fā)現(xiàn)Aβ25-35致細(xì)胞AD損傷后細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量明顯增加,Caspase-3活性顯著升高;RPEWM提取液能明顯降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量及Caspase-3活性,抑制Aβ25-35致細(xì)胞AD損傷后的細(xì)胞壞死或凋亡發(fā)生。

        綜上所述,Aβ25-35致神經(jīng)細(xì)胞AD損傷會引起細(xì)胞內(nèi)自由基大量增加,脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載,進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡;RPEWM有良好的抗神經(jīng)細(xì)胞AD損傷作用,其機(jī)制與抗自由基、抗氧化、抗鈣超載、抗凋亡等有關(guān)。

        [參考文獻(xiàn)]

        [1]肖移生,曾元鳳,徐玥璟,等. 黃精地龍方抗老年癡呆小鼠的研究[J]. 中藥藥理與臨床,2013,29(2):152-154

        [2]肖移生,曾元鳳,歐陽厚淦,等. 黃精地龍方對老年癡呆大鼠行為認(rèn)知及腦膽堿能系統(tǒng)的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2013,29(4):146-148

        [3]肖移生,侯吉華,伍慶華,等. 地龍對大鼠大腦局灶性腦缺血損傷保護(hù)作用研究[J]. 中藥藥理與臨床,2009,25(6):62-64

        [4]Joanna A,Ronald E,Eva B,et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling[J]. PloS One,2013,8(5):1-17

        [5]佟海俠,張繼紅,陸春偉,等. 全反式維甲酸體外誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的實驗研究[J]. 中國醫(yī)學(xué)工程,2007,15(1):37-42

        [6]Kim JH,Wang Q,Choi JM,et al. Protective role of caffeic acid in an Aβ25-35-induced Alzheimer’s disease model[J]. Nutr Res Pract,2015,9(5):480-488

        [7]Zhang S,Chen Y,Wu X,et al. The pivotal role of Ca2+homeostasis in PBDE-47-induced neuronal apoptosis[J]. Mol Neurobiol,2015,38(10):713-721

        Protective effects of Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures on the damage of Aβ25-35 to the differentiated SH-SY5Y cells

        XIAO Yisheng1, ZENG Yuanfeng2, HOU Jihua1, LI Qing1

        (1. The Basic Medicine College of Jiangxi University of TCM, Nanchang 330004, Jiangxi, China; 2. Jiangxi Province People’s Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi, China)

        Abstract:Objective It is to observe the functions of Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures (RPEWM) on the damage of Aβ25-35 to the differentiated SH-SY5Y cells. Methods The SH-SY5Y cells were differentiated to neuron by ATRA, then they were impaired by Aβ25-35 as the Alzheimer’s disease (AD) injury to cells, at the same time, the extraction of RPEWM were added to cells act as protector. Finally, we investigated the morphological behavior, survival rate, detected the SOD, LDH, MDA, GSH-Px levels, observed the intracellular calcium levels ([Ca2+]i), Caspase-3 activites of the AD model’s cells. Results Compared with model group, the extraction of RPEWM at the dose of 10-125 mg/L could significantly anti-AD impair to neuron cells, increase the cell viability and survival rate. Also, the extraction of RPEWM at the dose of 30, 60, 90 mg/L could decrease the [Ca2+]i, MDA, LDH level, lower Caspase-3 activites, and activate SOD, GSH-Px activites of the AD model’s cells. Conclusion RPEWM possess the function of anti-AD, can effectively protect the differentiated SH-SY5Y cells against AD impairment which exerted by Aβ25-35.

        Key words:The Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures; SH-SY5Y cell; Aβ25-35; Alzheimer’s disease

        [作者簡介]肖移生,男,碩士,副教授,研究方向為中藥抗衰老、抗腫瘤研究。 [通信作者]侯吉華,E-mail:794706902@qq.com

        [基金項目]2014年江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研基金項目(2014A014)

        doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.20.001

        [中圖分類號]R-33

        [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

        [文章編號]1008-8849(2016)20-2167-04

        [收稿日期]2016-01-17

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