□ 黃曉慶 晉中市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試所

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山西老陳醋中川芎嗪含量的測定及其不確定度分析

□ 黃曉慶 晉中市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試所

多年來，山西老陳醋憑借選料上乘、品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)成分豐富等優(yōu)點，成為我國釀造食醋久負(fù)盛名的品牌，而其獨特的食療保健作用也漸漸被認(rèn)識并開發(fā)使用。2014年10月1日實施的《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》的新標(biāo)準(zhǔn)就增加了具有擴張血管、防止血栓形成、改善腦缺血等多種作用的鹽酸川芎嗪這一特征指標(biāo)，該特征指標(biāo)的提出嚴(yán)格保證了山西老陳醋的品質(zhì)，而其中川芎嗪含量的精確測量就顯得尤為重要。

測量不確定度是評定測量水平的特性指標(biāo)，也是判定結(jié)果可靠程度的重要依據(jù)。本文主要利用UPLC對山西老陳醋中川芎嗪含量進行精確測量，并根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL06）和《測量不確定度評定與表示》（JJF1059-1999），對測量過程中可能引起不確定度的各因素進行分析和量化，最終計算出該方法的合成不確定度。

實驗部分

材料與試劑

鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品（分子式C8H12N2·HCl·5H2O，其中含C8H12N2·HCl以82.5℅計）：中國食品藥品檢定研究院；待測樣品為某品牌山西老陳醋；甲醇、磷酸二氫銨：色譜純；其余試劑為分析純。

儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：美國Waters公司；天平：梅特勒XP205；TGL-16A高速離心機：長沙平凡儀器儀表有限公司。

實驗方法

1 樣品處理方法

用5mL移液器準(zhǔn)確移取10mL樣品于125mL分液漏斗中，用NaOH溶液調(diào)至堿性（pH為8～9），加入5mL三氯甲烷，混勻萃取，離心分層，轉(zhuǎn)移三氯甲烷相，重復(fù)上述操作三次，合并三氯甲烷相。再以4.5mL濃度為0.2mol/L的鹽酸萃取三氯甲烷相兩次，合并水相，用超純水定容至25mL容量瓶中，經(jīng)0.22水相濾膜過濾備用。

2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制

準(zhǔn)確稱取川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.03060g，用超純水定容至100mL容量瓶中，即252.45g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，用超純水定容至10mL，即得到最終濃度分別為25.24 5 μg/Lm、50.49 μg/Lm、100.98 μg/Lm、151 .47 μg/Lm、201.96 μg/ Lm、252.45 μg/Lm，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾備用。

3 色譜條件

色譜注C181.7μm 2.1×50mm Column；流動相；0.2mmol/L磷酸二氫銨：色譜甲醇=7：3；流速0.2mL/min；柱溫：25℃；進樣量：2μL；檢測波長：279nm。

實驗結(jié)果

根據(jù)樣品的測量方法，建立數(shù)學(xué)模型為：

其中X為樣品中川芎嗪的含量；c為曲線得到樣品中川芎嗪的質(zhì)量濃度；V1為取樣體積；V2為試樣定容體積；R為樣品加標(biāo)回收率。

測量不確定度的分析與評定

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度產(chǎn)生的不確定度urel（c）

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液濃度的不確定度主要來自于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度、稱量和定容體積，其中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書已標(biāo)明含量為82.5%，代入計算，可忽略不計，因此，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的不確定度來源為以下兩個方面。

①標(biāo)物稱量所產(chǎn)生的不確定度主要由稱量變動性和天平校正不確定度引起。首先，根據(jù)廠家提供資料顯示天平變動性的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15mg，其不確定度為：

再者，根據(jù)天平的檢定證書給出天平偏載誤差±0.15mg，其不確定度為：

合成上述兩項不確定度分量得到：

②標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容所產(chǎn)生的不確定度分量主要為兩部分（考慮整個實驗過程在常溫下進行，則溫度變幅不大，且水的體膨脹系數(shù)較小，因此其所引起的不確定度可忽略）。

第一，容量瓶體積產(chǎn)生的不確定度分量。根據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器》檢定規(guī)程，20℃時100mL容量瓶允許誤差±0.10（A級），按照矩形分布計算標(biāo)準(zhǔn)偏差得：

第二，充滿液體的變動性產(chǎn)生的不確定度分量可以通過該容量瓶的典型樣品的重復(fù)性來評估。對典型樣品100mL容量瓶充滿10次并稱量的實驗，得出標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

合并上述兩項即為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)體積所產(chǎn)生的不確定度：

由①和②得到標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用過程產(chǎn)生的不確定度為：

移取試樣產(chǎn)生的不確定度

根據(jù)移液器的檢定證書，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01mL，則不確定度為：

試樣定容產(chǎn)生的不確定度urel（V2）

樣品最后定容至25mL容量瓶，不確定度同②中標(biāo)準(zhǔn)溶液體積所產(chǎn)生的不確定度，結(jié)果為urel（V2）=8.0×10- 4。

川芎嗪提取方法的準(zhǔn)確性所產(chǎn)生的不確定度（用回收率來表示即urel（R））

在待測樣品中加入濃度為100.98的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液進行回收率實驗，實驗測得6次回收率結(jié)果為96.21%、93.2 4%、94.0 8%、94.77%、95.32%、95.81%。平均值為R=94.905%，實驗標(biāo)準(zhǔn)偏差：

那么相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

方法重復(fù)性產(chǎn)生的不確定度urel（樣）

對實驗樣品進行8次重復(fù)測定，測量結(jié)果分別為56.79mg/L、55.80mg/ L、55.93mg/L、56.27mg/L、56.08mg/L、56.43mg/L、56.44mg/L、56.62mg/L。計算結(jié)果平均值cx=56.295mg/L，實驗標(biāo)準(zhǔn)偏差：

用回收率校正實驗結(jié)果為c0=56.295×94.905%=53.43mg/L，則方法重復(fù)性的相對不確定度為∶

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度是通過對空白和標(biāo)準(zhǔn)系列進行兩次重復(fù)檢測得到，空白溶液調(diào)零，測其峰面積，包含有峰面積重復(fù)測量引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣量引入的不確定度、儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)引入的不確定度和曲線擬合相關(guān)性引入的不確定度，結(jié)果如表1所示：

表1 兩次重復(fù)檢測的峰面積

根據(jù)測量數(shù)據(jù)用線性回歸方程y=ax+b求出校準(zhǔn)曲線，用最小二乘法擬合得到校準(zhǔn)曲線的斜率a=3901 7、截距b=125718和r=0.999642，回歸曲線測量峰面積的剩余標(biāo)準(zhǔn)差：

本實驗運用曲線測量時，被測樣品的測量次數(shù)p=8，標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)n=12，計算得到標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和Sxx=38769.7；樣品中川芎嗪含量的最佳估計值c0=53.43 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度c=130.4325mg/L，那么校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

校準(zhǔn)曲線線性擬合的相對不確定度為：

四、合成不確定度評定

綜合以上分析得到各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度情況匯總為表2，則實驗測得川芎嗪相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成：

擴展不確定度評定

表2 不確定度情況匯總

擴展不確定度是為了確定測量結(jié)果區(qū)間的量，取置信水平為95%，則包含因子k=2，那么該品牌山西老陳醋中川芎嗪含量測定的擴展不確定度為U=53.43×0.0096×2=1.03mg/L。

實驗結(jié)果

通過對山西老陳醋中川芎嗪含量的重復(fù)測定，并對其實驗過程中系統(tǒng)分析產(chǎn)生不確定度分量進行評估，最后計算得到擴展不確定度，該品牌山西老陳醋中鹽酸川芎嗪含量表示為c（X）=（53.43±1.03）mg/L（k=2）。根據(jù)上述不確定度評定結(jié)果表明，固體標(biāo)物使用及重復(fù)性對不確定度貢獻最大，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合影響最小。本方法也適合于超高效液相色譜法測定其他參數(shù)的不確定度分析計算。