□ 厲 芬 王鳳麗 朱佳茜 王新財(cái) 顧寬宇 湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院

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鐵皮石斛中有機(jī)磷的檢測方法分析

□ 厲 芬 王鳳麗 朱佳茜 王新財(cái) 顧寬宇 湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院

摘 要：本文研究的目的是制定一套成熟的鐵皮石斛藥材中有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留檢測方法，以期為中藥材中農(nóng)藥多殘留檢測方法的制定和完善提供依據(jù)。在空白鐵皮石斛中加入41種有機(jī)磷標(biāo)品，用水浸潤樣品，以丙酮和乙腈作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，GPC和Carb-NH2柱固相萃取聯(lián)用作為凈化方式，用FPD-GC檢測，發(fā)現(xiàn)各個(gè)農(nóng)藥的回收率在84.2%～105.8%，重復(fù)性在2.76%～6.58%，方法定量限在0.002～0.01 mg/kg，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；有機(jī)磷；凝膠凈化

鐵皮石斛為蘭科植物石斛屬鐵皮石斛新鮮或干燥的莖，其含有多糖、芪類、生物堿、氨基酸和微量元素等多種成分，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖和養(yǎng)陰生津等多種保健功能。鐵皮石斛的鮮莖可直接食用，也可燉湯、泡茶、浸酒，通常加工成干品，如鐵皮楓斗等。近年來，以鐵皮石斛為原料的保健品越來越多，暢銷國內(nèi)和國外市場。但由于野生鐵皮石斛資源較少，目前市場上多為栽培品，難免使用農(nóng)藥防治病蟲害，如農(nóng)藥使用不當(dāng)，農(nóng)藥殘留超標(biāo)將危及食品安全。

農(nóng)藥多殘留是指使用農(nóng)藥之后一個(gè)時(shí)期內(nèi)沒有被分降解而殘留于生物體內(nèi)、土壤、水體、大氣中的農(nóng)藥原體、降解物和有毒代謝物及雜質(zhì)的總稱。人們食用了被污染的中草藥及其保健制品后，殘留在其中的農(nóng)藥便會(huì)積聚在體內(nèi)，因其代謝緩慢，最終將導(dǎo)致急性或慢性中毒，產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。因此，世界各國對此高度重視，歐美國家都對傳統(tǒng)藥和草藥制定了非常嚴(yán)格的農(nóng)藥多殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)藥多殘留檢測屬于復(fù)雜混合物中痕量組分分析技術(shù)，中藥材保健品農(nóng)藥多殘留檢測具有以下特點(diǎn)：既需要精細(xì)的微量操作手段，又需要高靈敏度的痕量檢測技術(shù)［1］。農(nóng)藥多殘留量檢測方法的研究已成為影響中藥國際貿(mào)易的最重要技術(shù)要求之一，影響中藥保健品走向國際化與現(xiàn)代化。因此，研制簡單、快速、準(zhǔn)確，并可同時(shí)定性、定量的農(nóng)藥多殘留檢測方法是保障人民食品藥品安全，推動(dòng)中藥材保健食品的現(xiàn)代化建設(shè)迫切需要解決的問題之一。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

所用水為經(jīng)過二次蒸餾的重蒸水；丙酮、乙腈、二氯甲烷（色譜純，默克公司）；41種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；無水硫酸鈉（分析純，麥克林）。

本實(shí)驗(yàn)采用的鐵皮石斛，采購自湖州仁皇山街道康龍保健食品商行。

1.2 設(shè)備儀器

GC-FPD（Agilent7890B）、自動(dòng)固相萃取儀（LAB TECH）、高速勻漿機(jī)（德國 IKA）、氮吹儀（美國Organomation）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA）、恒溫水浴振蕩器（上海精風(fēng)儀器有限公司）、旋渦混勻器（IKAM S1）、高速冷凍離心機(jī)（貝克曼）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

提取：稱取2 g飲片樣品粉狀于均質(zhì)杯中（新鮮的鐵皮石斛先干燥至水分含量低于12.0%），加入6 mL水和5 m L丙酮，充分膨脹，振蕩渦旋，然后加入20 mL乙腈，12 000 r/min均質(zhì)1分鐘；再用20 mL乙腈，均質(zhì)1分鐘，濾紙過濾于裝有10 m L飽和氯化鈉溶液中，收集濾液，蓋上蓋，劇烈震蕩2 min，室溫靜置20 min，分層；取濾液過無水硫酸鈉，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2～3 m L，氮?dú)獯抵两?，用丙酮定容? mL［2］。

凈化：Carb-NH2柱進(jìn)一步凈化。在Carb-NH2 柱中加入 1 cm無水硫酸鈉，預(yù)先用 5 mL丙酮+二氯甲烷（1∶1）活化小柱，把待凈化液加到已活化好的 Carb-NH2柱上，使其逐滴流下，用5 mL×2次丙酮+二氯甲烷（1∶1）洗脫。41℃以下水浴氮吹濃縮至近干，用2 mL丙酮溶解定容，供GC-FPD分析。

1.3.2 GC色譜條件

色譜柱：安捷倫DB-17（30 m ×0.32 mm× 0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：220℃；檢測器溫度：250℃；柱溫程序升溫：150℃保持2分鐘，以8℃/ min升至250℃，保持12分鐘；柱流速：1 mL/min；不分流進(jìn)樣；載氣：氮?dú)?，純度?9.999%［2］。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取過程加水的考察

本試驗(yàn)考察樣品在提取前加不加適量的水來考察提取效果，發(fā)現(xiàn)水浸潤后提取液澄清透明，因?yàn)榧尤脒m量的水能增加粉狀樣品之間的吸附力，經(jīng)過離心后能完全達(dá)到固液分離。不加水，提取后提取液渾濁，并且有粉末和纖維漂浮在上面，從而影響下面的試驗(yàn)。并且加了水能使提取溶劑更好地浸入樣品中，從而有利于農(nóng)藥殘留的提取［3］。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不加水各個(gè)農(nóng)藥回收率為53.1%～82.5%，而加水回收率提升到了86.2%～103.7%。因此，在有機(jī)溶劑提取樣品前應(yīng)先加入適量的水浸潤。

2.2 提取溶劑的選擇

本試驗(yàn)考察了正己烷、丙酮及乙腈這3種溶劑，發(fā)現(xiàn)丙酮和乙腈的提取效果最佳，正己烷不適合，正己烷雖然對于色素溶解性差，但是單獨(dú)不能充分滲透到樣品內(nèi)部［3］，且不能與水相溶，使提取效率較低，41種有機(jī)磷回收率在32.9%～67.2%。丙酮這種極性物質(zhì)雖然滲透性強(qiáng)，但是在提取過程中也同時(shí)提取出大量的雜質(zhì)，使樣品的目標(biāo)峰被某些雜質(zhì)所干擾。

乙腈滲透性強(qiáng)，并且對于雜質(zhì)的提取效果沒有丙酮有效。鑒于最后檢測的檢測器為FPD檢測器，特征光經(jīng)過磷濾光片，再由光電倍增管進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換后只產(chǎn)生相應(yīng)的電信號(hào)，因此可排除大量溶劑峰及烴類的干擾，經(jīng)過后續(xù)的凈化可以滿足檢測的要求。各個(gè)有機(jī)磷的回收率為84.6%～103.8%。

表1 不同提取方法的比較

圖1 第一有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 第二有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖3 第三有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖4 第四有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.3 提取方式的選擇

中藥材基質(zhì)復(fù)雜，提取難滲透，選用適宜的提取方法，能讓提取溶劑與鐵皮石斛基質(zhì)充分接觸、滲透。本試驗(yàn)選用振蕩提取、超聲波提取和高速均漿提取3種方法考察，發(fā)現(xiàn)振蕩提取效果較差，超聲波提取其次，高速勻漿法提取效果最好。

樣品中加入的提取溶劑的量對于振蕩提取影響比較大，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提取溶劑加入量越大，提取的回收率越高，但是隨著提取溶劑增加，回收率提升的幅度越來越小。加入少量的溶劑，在振蕩提取中不能充分與樣品內(nèi)部接觸，從而導(dǎo)致提取不充分，但是大量的溶劑增加會(huì)相應(yīng)的增加成本，并且振蕩提取的時(shí)間也相對比較長［4］。

超聲波提取也是農(nóng)藥殘留中常見的提取方法，但是在提取過程中，超聲波內(nèi)部水溫會(huì)隨著提取時(shí)間增長而升高，而部分農(nóng)藥殘留具有熱不穩(wěn)定性及揮發(fā)性，因此造成了部分農(nóng)藥殘留回收率低下。在整個(gè)超聲容器中超聲波場的分布是不均勻的，類似在波場的分布中有死角，這會(huì)使部分樣品的提取效率顯著下降，從而導(dǎo)致重現(xiàn)性較差。

使用高速均漿法能在較短時(shí)間，用較少溶劑得到較好的回收率，并且重現(xiàn)性也較好。高速均漿是樣品在高速攪拌下從攪拌縫隙高速噴出，高壓高速情況下使鐵皮石斛的粉末進(jìn)一步被破壞細(xì)化，從而使提取溶劑與鐵皮石斛粉末充分接觸，提高了提取效率，并且提取時(shí)間也進(jìn)一步縮短。

本試驗(yàn)也考察了超聲波與振蕩聯(lián)用、超聲波與均漿聯(lián)用、振蕩與均質(zhì)聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)超聲波與振蕩聯(lián)用回收率有了提高，但是還是沒有達(dá)到試驗(yàn)要求。后面兩者回收率與單獨(dú)使用均漿法相差不多，因此選用高速勻漿法作為本試驗(yàn)的提取方法。

2.4 SPE凈化柱的選擇

樣品經(jīng)過提取，含有大量的色素、糖類物質(zhì)，因此選用合適的固相萃取柱對樣品的檢測非常重要。本試驗(yàn)選用Carb- NH2柱、弗羅里硅土柱、C18柱和氨基柱，發(fā)現(xiàn)通過Carb-NH2柱能有效除去色素及糖類物質(zhì)，而弗羅里硅土柱、C18柱和氨基柱這3款柱子經(jīng)過樣品凈化，凈化液還是呈現(xiàn)綠色，通過氣相色譜檢測，還是有很多雜質(zhì)干擾。

因此選用Carb-NH2柱，經(jīng)過FPD檢測器檢測，基本凈化完全，滿足藥材中有機(jī)磷的檢測要求，各個(gè)有機(jī)磷的回收率在84.7%～102.7%。

2.5 前處理方法學(xué)考證

樣品中加入分成四組的41種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行加標(biāo)回收、檢出限及重復(fù)性試驗(yàn)［5］。

精密稱取鐵皮石斛樣品40份，各個(gè)農(nóng)藥加標(biāo)濃度為0.05 mg/kg和0.5 mg/kg兩個(gè)添加水平，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，通過GC- FPD檢測，發(fā)現(xiàn)各個(gè)農(nóng)藥的回收率在84.2%～105.8%，重復(fù)性在2.76%～6.58%，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

圖5 空白樣品色譜圖

圖6 空白樣品第一組有機(jī)磷加標(biāo)濃度0.05 mg/kg色譜圖

圖7 空白樣品第二組有機(jī)磷加標(biāo)濃度0.05 mg/kg色譜圖

圖8 空白樣品第三組有機(jī)磷加標(biāo)濃度0.05 mg/kg色譜圖

圖9 空白樣品第四組有機(jī)磷加標(biāo)濃度0.05 mg/kg色譜圖

3 結(jié)論

本文建立了41種有機(jī)磷在飲片鐵皮石斛中的GC- FPD的前處理方法：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件，用水浸潤樣品，以丙酮和乙腈作為提取溶劑，高速均漿為提取手段，Carb-NH2柱固相萃取作為凈化方式。該方法既可有效提取鐵皮石斛中農(nóng)藥殘留，又可完全去除雜質(zhì)干擾，簡便、省時(shí)、結(jié)果準(zhǔn)確。所建立的分析方法各個(gè)農(nóng)藥的回收率在84.2%～105.8%，重復(fù)性在2.76%～6.58%，方法定量限在0.002～0.01 mg/kg符合農(nóng)藥殘留檢測要求。

參考文獻(xiàn)：

［1］田金改，杜慶鵬，高天兵.HPLC測定中藥中農(nóng)藥滅幼脲殘留量的方法研究［J］.中草藥，2000，31（3）：179-181.

［2］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定（NY/T761-2008）［S］.2008.

［3］李慶，劉漢蘭.中草藥農(nóng)藥殘留分析的研究進(jìn)展［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2002，21（2）：195-200

［4］董順玲，胡家熾，何志強(qiáng)，等.中藥材中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的反相高效液相色譜法［J］.藥物分析雜志，2002，22（3）：178-182

［5］巢志茂.瓜萎中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的含量測定［J］.中國藥學(xué)雜志，2004，39（3）：179-181.