蔣威華，李涌濤，張 杰，張明帥，王曉文，張晨光，伊麗娜，歐江華

?

·論著·

表皮生長因子受體在不同民族三陰性乳腺癌患者中的表達差異分析

蔣威華，李涌濤，張 杰，張明帥，王曉文，張晨光，伊麗娜，歐江華

830011新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科二病區(qū)

【摘要】目的探討不同民族三陰性乳腺癌(TNBC)患者表皮生長因子受體(EGFR)的表達情況，了解其與預后的關系。方法選取2008年5月—2010年5月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院住院的TNBC患者184例，其中漢族130例、維吾爾族54例。采用PV-9000免疫組化法測定EGFR的表達情況，采用Spearman秩相關分析探討EGFR表達與淋巴結轉移情況及TNM分期的相關性，同時采用Kaplan-Meier法繪制5年無瘤生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。結果漢族TNBC患者EGFR陽性表達率為40.8%(53/130)，維吾爾族TNBC患者EGFR陽性表達率為57.4%(31/54)，二者間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.270，P=0.039)。漢族、維吾爾族TNBC患者EGFR陽性表達率與淋巴結轉移數均呈正相關(rs值分別為0.370、0.950，P<0.05)。漢族、維吾爾族TNBC患者EGFR陽性表達率與TNM分期均呈正相關(rs值分別為0.380、0.371，P<0.05)。通過5年的隨訪觀察，漢族TNBC患者復發(fā)轉移發(fā)生率為24.6%(32/130)，而維吾爾族TNBC患者復發(fā)轉移發(fā)生率為29.6%(16/54)；二者5年無瘤生存曲線間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.564，P=0.453)。結論不利于腫瘤預后的EGFR在漢族TNBC患者中的陽性表達率低于維吾爾族TNBC患者，但二者5年無瘤生存期間無明顯差異，提示維吾爾族TNBC患者可能存在與漢族TNBC患者不同的預后影響因素，建議進一步探討影響漢族、維吾爾族TNBC患者預后的相關因素。

【關鍵詞】乳腺腫瘤；受體,表皮生長因子；漢族；維吾爾族

蔣威華，李涌濤，張杰，等.表皮生長因子受體在不同民族三陰性乳腺癌患者中的表達差異分析[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(19)：2297-2301.[www.chinagp.net]

JIANG W H,LI Y T,ZHANG J,et al.Differences of the expression of epidermal growth factor receptor among patients with triple negative breast cancer of different ethnic groups[J].Chinese General Practice，2016，19(19)：2297-2301.

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是目前乳腺癌研究關注的焦點，與非TNBC相比，侵襲性強、遠處復發(fā)和死亡風險更高、生存期短，臨床預后差，在年輕患者和老年患者中有著相似的生存率[1-2]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因C-erbB1的表達產物，參與激活一系列復雜的細胞信號轉導途徑，在上皮、間質及神經源性組織中都有表達，EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用[3]，與TNBC細胞的生長活躍程度密切相關[4]，隨著目前不同種族TNBC的差異問題日益受到重視，本研究通過檢測中國新疆地區(qū)漢族、維吾爾族女性TNBC患者EGFR的陽性表達情況，分析其是否存在差異，并探討其與預后間的關系，為不同民族TNBC患者的異種亞型分析提供數據[5]，同時也為進一步了解影響TNBC患者的預后因素提供一定的依據。

1對象與方法

1.1研究對象在2008年5月—2010年5月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院住院的乳腺癌患者1 003例中，選取雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)表達均陰性即TNBC患者184例，均為女性。納入標準：(1)在本院首次治療，且可以手術；(2)漢族、維吾爾族；(3)經本院免疫組化確認標記ER、PR及HER-2表達均陰性。排除標準：臨床病理資料不完整者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審批，患者均知情同意并簽署同意書。

1.2方法

1.2.1EGFR檢測方法采用PV-9000免疫組化法測定EGFR的表達：(1)組織經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，蒸餾水沖洗，4 μm 連續(xù)切片，并以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min；(2)清除內源性過氧化物酶活性〔以3%過氧化氫(H2O2)溶液室溫孵育5～10 min〕，PBS沖洗2 min×3次；(3)滴加EGFR一抗，37 ℃孵育1.5 h，PBS沖洗2 min×3次；(4)滴加聚合物輔助(polymer helper)試劑1，室溫孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次；(5)滴加鼠抗過氧化物酶聚合物(polymer peroxidase-anti-mouse)IgG試劑2，室溫孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次；(6)室溫下DAB試劑顯色約5 min；(7)自來水沖洗后復染、脫水透明、封固、記錄、拍照。

1.2.2EGFR結果判讀(1)陰性表達為細胞質或細胞膜無明顯染色，分值0分；低度陽性(+)表達為視野中>10%的區(qū)域呈現棕色或棕褐色但細胞膜染色不連續(xù)，分值1分；中度陽性(++)表達為>10%的區(qū)域呈棕色或棕褐色且細胞膜染色連續(xù)，但形態(tài)不完整，分值2分；強陽性 (+++)表達為>10%區(qū)域呈棕色或棕褐色，同時細胞膜染色連續(xù)且形態(tài)完整，分值3分。而細胞輕度棕色或棕褐色染色計1分；中度棕色或棕褐色染色計2分；重度棕色或棕褐色染色計3分。(2)將分值相加，最后EGFR總分值≤2分為陰性，>3分為陽性(見圖1、2)。

注：PV-9000免疫組化法，DAB顯色，×200；EGFR=表皮生長因子受體

圖1EGFR陽性表達

Figure 1Positive expression of EGFR

注：PV-9000免疫組化法，DAB顯色，×200

圖2EGFR陰性表達

Figure 2Negative expression of EGFR

1.2.3資料收集記錄所有患者的發(fā)病年齡、初潮年齡、初產年齡、絕經情況、乳腺癌家族史及腋窩淋巴結轉移情況、腫瘤TNM分期等。

1.2.4隨訪方式采用入院復查和電話等隨訪方式,將患者術后第1次化療開始定為隨訪起始時間，觀察所有患者治療后復發(fā)轉移情況；發(fā)生復發(fā)轉移為終止事件，隨訪時間為5年，隨訪截止日期為2015-05-30。

1.3觀察指標包括EGFR陽性表達率、復發(fā)轉移發(fā)生率、5年無瘤生存期。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數資料采用χ2檢驗；EGFR表達與淋巴結轉移情況及TNM分期的相關性采用Spearman秩相關分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1漢族與維吾爾族TNBC患者基本情況比較漢族與維吾爾族TNBC患者發(fā)病年齡、初潮年齡、初產年齡、絕經情況、乳腺癌家族史間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)，具有可比性。

2.2漢族與維吾爾族TNBC患者EGFR表達情況比較漢族TNBC患者EGFR陽性表達率為40.8%(53/130)，維吾爾族TNBC患者EGFR陽性表達率為57.4%(31/54)，二者間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.270，P=0.039)。

2.3漢族、維吾爾族不同淋巴結轉移數TNBC患者EGFR表達情況比較漢族、維吾爾族不同淋巴結轉移數TNBC患者EGFR陽性表達率間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。漢族、維吾爾族TNBC患者EGFR陽性表達率與淋巴結轉移數均呈正相關(rs值分別為0.370、0.950，P<0.05)。

2.4漢族、維吾爾族不同TNM分期TNBC患者EGFR表達情況比較漢族、維吾爾族不同TNM分期TNBC患者EGFR陽性表達率間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。漢族、維吾爾族TNBC患者EGFR陽性表達率與TNM分期均呈正相關(rs值分別為0.380、0.371，P<0.05)。

2.5漢族與維吾爾族TNBC患者復發(fā)轉移情況比較通過5年的隨訪觀察，漢族TNBC患者復發(fā)轉移發(fā)生率為24.6%(32/130)，而維吾爾族TNBC患者復發(fā)轉移發(fā)生率為29.6%(16/54)；二者5年無瘤生存曲線間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.564，P=0.453，見圖3)。

3討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與遺傳、生理及環(huán)境因素都有關。自2000年PEROU等[6]提出TNBC的概念以來，由于其預后差、進展快等特點，很快成為乳腺癌研究關注的焦點。TNBC分子生物學特征復雜，與非TNBC相比，有著不同的臨床病理特征及預后，鑒于目前關于TNBC的臨床報道多限于漢族普通人群，缺乏在不同民族當中的對照研究，且不同種族TNBC分子生物學特性并不相同，本研究對新疆不同民族TNBC患者中的EGFR表達差異做一統(tǒng)計分析，以期更進一步了解影響TNBC的發(fā)生發(fā)展因素。

表1　漢族與維吾爾族TNBC患者一般情況比較〔n(%)〕

注：TNBC=三陰性乳腺癌

表2漢族、維吾爾族不同淋巴結轉移數TNBC患者EGFR表達情況比較〔n(%)〕

Table 2Comparison of EGFR expression in Han and Uygur TNBC patients with different number of lymph node metastasis

淋巴結轉移數(個)例數EGFR陽性表達χ2值P值漢族20.490<0.001 05012(24.0) 1～34918(36.7) ≥43123(74.2)ab維吾爾族8.4470.015 0207(35.0) 1～31710(58.8) ≥41714(82.4)a

注：與0個淋巴結轉移數比較，aP<0.017；與1～3個淋巴結轉移數比較，bP<0.017；EGFR=表皮生長因子受體

表3漢、維吾爾族不同TNM分期TNBC患者EGFR表達情況比較〔n(%)〕

Table 3Comparison of EGFR expression of Han and Uygur TNBC patients at different TNM stages

TNM分期例數EGFR陽性表達χ2值P值漢族27.710<0.001 Ⅰ期478(17.0) Ⅱ期5020(40.0)a Ⅲ期3325(75.8)ab維吾爾族7.4520.024 Ⅰ期134(30.8) Ⅱ期2212(54.5) Ⅲ期1915(78.9)a

注：與I期比較，aP<0.017；與Ⅱ期比較，bP<0.017

注：TNBC=三陰性乳腺癌

圖3漢族與維吾爾族TNBC患者5年無瘤生存曲線比較

Figure 3Comparison of 5-year disease-free survival curves between Han and Uygur TNBC patients

3.1EGFR在漢族、維吾爾族TNBC患者中的表達情況EGFR是生長因子受體家族成員之一，EGFR信號通路對細胞的增殖、分化、生長有重要調節(jié)作用，作為原癌基因C-crb編碼的跨膜蛋白，其表達于正常上皮細胞。有研究發(fā)現，在腫瘤的進展過程中，EGFR的異常表達和活化，與腫瘤血管生成、侵襲、轉移等一系列生物學行為密切相關[7]。也是與乳腺癌關系最為密切的一類生長因子受體，其受體與相應配體結合導致其酪氨酸磷酸化，進而激活一系列信號轉導通路，如表皮生長因子(EGF)通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路，活化原癌基因c-fos 刺激細胞惡性增殖，引起TNBC細胞的激素非依賴性生長[3],針對其分子靶向治療的代表性藥物是吉非替尼(Gefitinib)，主要作用于EGFR胞內酪氨酸激酶，與ATP競爭并抑制其功能。有研究認為，TNBC患者中EGFR和p53高表達、磷酸酶與張力蛋白同源基因(PTEN)低表達，三者協同導致TNBC疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。本研究中EGFR陽性表達率為45.7% (84/184)；與國外報道的EGFR在TNBC患者中的陽性表達率為45%～70%的結論基本一致[9]。但本研究發(fā)現，漢族TNBC患者EGFR陽性表達率明顯低于維吾爾族TNBC患者。分析原因，考慮新疆地區(qū)乳腺癌防治工作較為欠缺，部分偏遠山區(qū)農牧患者自我保健及篩查意識落后，其就診時病期已偏晚，此類患者的病期情況(腫瘤組織學分級、腋窩淋巴結轉移及TNM分期)均有可能影響到EGFR在不同民族間的表達情況。

3.2EGFR陽性表達率與漢族、維吾爾族TNBC患者淋巴結轉移數、TNM分期的相關性分析本研究發(fā)現，漢族TNBC患者5年內復發(fā)轉移發(fā)生率為24.8%，而維族TNBC患者復發(fā)轉移發(fā)生率為29.6%，二者5年無瘤生存曲線間無明顯差異。

EGFR在TNBC患者中過度表達，與淋巴結轉移數、TNM分期有一定相關性，EGFR過度表達的患者，容易早期復發(fā)、轉移，通常預后較差[10]。本研究顯示，EGFR陽性表達率與漢族、維吾爾族TNBC患者淋巴結轉移數、TNM分期均呈正相關，EGFR陽性表達隨著淋巴結轉移數及TNM分期的增高而逐漸升高，說明EGFR在TNBC的進展過程中起到了一定作用。淋巴結轉移和TNM分期是臨床判斷預后的重要依據，而兩者也是制定個體化綜合治療方案的重要參考依據，EGFR與淋巴結轉移情況和TNM分期的相關性也進一步提示，應高度重視不同民族TNBC患者中EGFR高度表達差異，作為TNBC分子靶向治療的突破口及新靶點，其臨床意義重大，應針對不同民族患者中的TNBC生物學特征，采取不同的個體化治療策略，以期進一步改善患者的預后情況。

綜上所述，本研究結果顯示，漢族與維吾爾族TNBC患者5年無瘤生存曲線間無差異，但EGFR陽性表達率間有差異；同時EGFR陽性表達率與淋巴結轉移數、TNM分期均呈正相關。有研究表明，EGFR作為判斷TNBC預后的獨立因素，當其在乳腺癌患者中高表達時，往往提示預后較差[11]。本研究發(fā)現EGFR在漢族TNBC患者中的陽性表達率低于維吾爾族TNBC患者，但二者的5年無瘤生存曲線間無差異，因此，本研究認為維吾爾族TNBC患者可能存在與漢族TNBC患者不同的預后影響因素，建議進一步研究影響漢族、維吾爾族TNBC預后的相關因素。由于本研究的樣本量較小，在后續(xù)的研究中將擴大樣本并加以完善，以期進一步探討新疆地區(qū)不同民族TNBC患者的EGFR表達情況。

作者貢獻：蔣威華負責課題設計與實施、資料收集與整理，撰寫論文、成文并對文章負責；李涌濤、張杰、張明帥、王曉文、張晨光、伊麗娜進行課題實施、評估、資料收集；歐江華進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]MILLIKAN R C,NEWMAN B,TSE C K,et al.Epidemiology of basal-like breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2008,109(1):123-139.DOI：10.1007/s10549-007-9632-6.

[2]王志光，林麗珠.疏肝健脾益腎中藥聯合化療治療肝郁型轉移性三陰性乳腺癌患者療效及安全性研究[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(6)：620-624.DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2015.06.05.

WANG Z G,LIN L Z.Clinical efficacy and safety of combined chemotherapy with traditional Chinese medicine for smoothing liver,invigorating spleen and tonifying kidney in the treatment of metastatic triple negative breast cancer with liver stagnation[J].Chinese General Practice,2015,18(6):620-624.DOI:10.3969/j.issn.1007-9572.2015.06.05.

[3]CIARDIELLO F,TORTORA G.EGFR antagonists in cancer treatment[J].N Engl J Med,2008,358(11):1160-1174.DOI：10.1056/NEJMra0707704.

[4]NORMANNO N,CAMPIGLIO M,MAIELLO M R,et al. Breast cancer cells with acquired resistance to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib show persistent activation of MAPK signal[J].Breast Cancer Res Treat，2008，112(1):25-33.DOI：10.1007/s10549-007-9830-2.

[5]KARN T,RDDY A,MULLER V,et al.Control of dataset bias in combined Affymetrix cohorts of triple negative breast cancer[J].Genom Data,2014,23(2):354-356.DOI：10.1016/j.gdata.2014.09.014.

[6]PEROU C M,SORLIE T,EISEN M B,et al.Molecular portraits of human breast tumours[J].Nature,2000,406(6797):747-752.DOI：10.1038/35021093.

[7]駱廣濤，王本忠.乳腺癌中EZH2與miRNA調控關系的研究進展[J].安徽醫(yī)學，2015，36(8)：1034-1036.DOI：10.3969/j.issn.1000-0399.2015.08.040.

[8]LI X,WANG Q,FU L,et al.Expression of PTEN,p53 and EGFR in the molecular subtypes of breast carcinoma and the correlation among them[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2015,40(9):973-978.DOI：10.11817/j.issn.1672-7347.2015.09.005.

[9]NIELSEN T O,HSU F D,JENSEN K,et al.Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma[J].Clin Cancer Res，2004，10 (16)：5367-5374.DOI：10.1158/1078-0432.CCR-04-0220.

[10]RAKHA E A,EI-SAYED M E,GREEN A R,et al.Prognostic markers in triple-negative breast cancer[J].Cancer,2007,109(1):25-32.DOI：10.1002/cncr.22381.

[11]SOLIE T,TIBSHIRANI R,PARKER J,et al.Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets[J].Proc Natl Acad,2003,100(14):8418-8423.DOI：10.1073/pnas.0932692100.

(本文編輯：崔沙沙)

Differences of the Expression of Epidermal Growth Factor Receptor Among Patients With Triple Negative Breast Cancer of Different Ethnic Groups

JIANGWei-hua,LIYong-tao,ZHANGJie,etal.

TheSecondWardofBreastSurgeryDepartment,theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in patients with triple negative breast cancer (TNBC) of different ethnic groups and its relation with prognosis.MethodsFrom May 2008 to May 2010,184 TNBC patients who were admitted into the Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University were enrolled,including 130 Han patients and 54 Uygur patients.PV-9000 immunohistochemistry method was used to determine the expression of EGFR,and Spearman correlation analysis was performed to explore the correlation between EGFR expression and lymphatic metastasis as well as TNM staging.Kaplan-Meier method was employed to draw 5-year tumor-free survival curves,and intergroup comparison was performed by Log-rank test.ResultsThe positive expression rate of EGFR was 40.8%(53/130) for Han TNBC patients and 57.4%(31/54)for Uygur TNBC patients,and there was significant difference between them (χ2=4.270，P=0.039).There was positive correlation between the positive rate of EGFR and the number of lymph node metastasis (rs values were 0.370 and 0.950 respectively，P<0.05).There was positive correlation between the positive rate of EGFR and TNM staging (rs values were 0.380 and 0.371 respectively，P<0.05).By 5-year follow-up observation,the incidence of recurrence and metastasis of Han TNBC patients was 24.6%(32/130),and that of TNBC Uygur patients was 29.6%(16/54);the two groups were not significantly different in 5-year disease-free survival curve (χ2=0.564，P=0.453).ConclusionThe positive expression rate of EGFR which is unfavorable to the prognosis of tumor is lower among Han TNBC patients than Uygur TNBC patients,but they have no marked difference in the 5-year disease-free survival curve,which suggest that the influencing factors for the prognosis of Uygur TNBC patients may be different from those of Han TNBC patients.We suggest that the relevant influencing factors for the prognosis of Han and Uygur patients should be further investigated.

【Key words】Breast neoplasms;Receptor,epidermal growth factor;Han nationality;Uygur nationality

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81260390)——中度風險易感基因CHEK2、PALB2、CDH1 篩查在多民族地區(qū)BRCA1/2 突變陰性遺傳性乳腺癌中的作用

通信作者：歐江華，830011新疆烏魯木齊市，新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科二病區(qū)；E-mail:oujianghua@hotmail.com

【中圖分類號】R 737.9

【文獻標識碼】A

DOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.19.015

(收稿日期：2016-03-18；修回日期：2016-05-09)