李　軍，孫玉坤，孫云峰，劉　麗，范　穎，張立德

?

HPLC同時(shí)測定龍須草中2個(gè)菲類化合物的含量

李軍1,2，孫玉坤3，孫云峰1,2，劉麗1,2，范穎1,2，張立德2*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110032；2.遼

[摘要]目的建立HPLC法測定龍須草中的厄弗酚和去氫厄弗酚含量。方法采用色譜柱：Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)為流動相進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：25 ℃。結(jié)果厄弗酚進(jìn)樣量為1.92～48.00 μg (r=0.999 5)、去氫厄弗酚進(jìn)樣量為4.13～103.25 μg (r=0.999 3)時(shí)線性關(guān)系良好，兩者的平均回收率分別為100.06% (RSD=0.91%，n=6)、99.89% (RSD=1.35%，n=6)。結(jié)論本方法簡便、快速、準(zhǔn)確，適用于厄弗酚和去氫厄弗酚的含量測定，為龍須草藥材的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]龍須草；菲類化合物；燈芯草科；厄弗酚；去氫厄弗酚

0引言

龍須草(JuncussetchuensisBuchen.)又稱野燈芯草、水通草，為燈心草科(Juncaceae)燈心草屬的植物，多年生草本，廣泛分布于我國的江蘇、山東、安徽、浙江、江西、福建、河南、廣東、湖南、四川、貴州、云南、西藏等省區(qū)，資源十分豐富[1]。龍須草以其干燥的莖髓入藥，具有清心火、利小便的功效，可用于小便不利、尿道刺痛、口舌生瘡、水腫、心煩不寐等癥[2]。化學(xué)成分研究表明，龍須草中主要含有菲類、二氫菲類、黃酮類、甾體等成分，其中以菲類、二氫菲類化合物為主要成分[3-5]。國內(nèi)外研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，燈心草屬植物中的菲類化合物具有抗菌、抗焦慮、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜等活性[6-8]。本研究采用HPLC技術(shù)，建立了同時(shí)測定中藥龍須草所含的厄弗酚和去氫厄弗酚2種菲類成分的分析方法，此方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，為中藥龍須草的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器日本島津LC-20AT高效液相色譜儀，二元泵系統(tǒng)，SPD-20A紫外檢測器；美國MILLIPORE SIMS50000 超純凈水器；KQ-100b型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；TD-25電子分析天平(丹佛儀器北京有限公司，十萬分之一)；SF-130B高速粉碎機(jī)(上海冠聯(lián)制藥儀器有限公司)，鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海精宏儀器設(shè)備有限公司)。

1.2試藥厄弗酚和去氫厄弗酚對照品(本實(shí)驗(yàn)室分離純化，經(jīng)UV、NMR、MS、IR 鑒定，HPLC 純度不低于98%，符合定量要求)；龍須草藥材采自7個(gè)不同產(chǎn)地，分別為江西省的南昌、上饒、景德鎮(zhèn)、九江、鷹潭，安徽省的黃山、銅陵，以上產(chǎn)地龍須草藥材經(jīng)鑒定均為燈心草植物龍須草JuncussetchuensisBuchen.的干燥莖髓；高效液相色譜用水為MILLIPORE超純水機(jī)制備超純水，甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。甲醇為流動相A，0.1%甲酸水溶液為流動相B。梯度洗脫：0～10 min，30%～30%A；10～35 min，30%～50% A；35～45 min，50%～50% A。記錄對照品溶液、樣品溶液的色譜圖,見圖1。

圖1　HPLC色譜圖

2.2供試品溶液制備取龍須草藥材適量，粉碎，取1.0 g，精密稱定，置于具塞三角燒瓶內(nèi)，精密加入40 mL甲醇，稱定重量并記錄后，超聲處理30 min (250 W，40 kHz)，取出，放至室溫，再稱重，用甲醇補(bǔ)充損失的重量，充分搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，備用。

2.3對照品溶液制備精密稱定厄弗酚(0.019 2 g)和去氫厄弗酚(0.041 3 g)置于50 mL容量瓶中，加甲醇充分溶解并稀釋至刻度線后，溶解搖勻；精密吸取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為38.4、82.6 μg/mL的對照品溶液，備用。

2.4線性關(guān)系考察分別精密量取混合對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，測定峰面積值，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得2種成分的回歸方程：Y=83 123 X-166 512，r=0.999 5，表明厄弗酚在0.038 4～0.96 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系；Y=221 607 X+607 284，r=0.999 3，表明去氫厄弗酚在0.082 6～2.065 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn)取混合對照品溶液20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。厄弗酚和去氫厄弗酚峰面積的RSD值為1.12%和0.87%，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定峰面積，結(jié)果厄弗酚和去氫厄弗酚峰面積的RSD值分別為0.98%和0.56%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一產(chǎn)地(江西南昌)樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法平行處理，制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件取供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析。厄弗酚和去氫厄弗酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.37%、1.05%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取含量已知的樣品(江西南昌) 6份，粉碎，分別取1.0 g，精密稱定，置于具塞三角燒瓶內(nèi)，分別加入厄弗酚和去氫厄弗酚對照品適量，按“2.2”項(xiàng)方法處理，制備供試品溶液。測得厄弗酚的平均回收率為100.06%(n=6)，RSD=0.91%；去氫厄弗酚的平均回收率為99.89%(n=6)，RSD=1.35%。見表1。

2.9樣品的測定取采自江西和安徽不同地區(qū)的7批樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，分別計(jì)算厄弗酚和去氫厄弗酚的含量。見表2。

3討論

3.1提取方法的選擇在溶劑的選擇上，本研究分別采用氯仿、丙酮、甲醇及乙醇，在提取方法上采用加熱回流、超聲和索式提取，并選擇不同提取時(shí)間(10、20、30、40、60 min)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，甲醇超聲提取30 min的提取效果最優(yōu)。

3.2流動相系統(tǒng)選擇本研究分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-水的等度和梯度洗脫，結(jié)果表明，用甲醇-0.1%甲酸梯度洗脫，2種成分均能與雜質(zhì)達(dá)到較好的分離效果。

表1　厄弗酚和去氫厄弗酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

表2　不同產(chǎn)地龍須草中厄弗酚和去氫厄弗酚

3.3檢測波長的選擇在上述液相色譜條件下，以光電二極管陣列檢測器對厄弗酚和去氫厄弗酚的對照品混合溶液，于波長200～400 nm繪制成三維圖譜，結(jié)果厄弗酚和去氫厄弗酚2個(gè)對照品分別在272、262 nm波長處有最大吸收峰，同時(shí)為了兼顧與龍須草中其他成分的分離度符合要求，故選擇260 nm為檢測波長。

厄弗酚和去氫厄弗酚是藥用植物龍須草中所含的典型菲類化合物，其含量也較高，并且在藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出多種活性，所以，上述2個(gè)化合物非常適合作為龍須草藥材質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品。菲類化合物由于自身特殊的芳香共軛結(jié)構(gòu)，其紫外吸收強(qiáng)，很適合用紫外檢測器來測定含量[9-10]；另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，通過核磁共振技術(shù)(NMR)[11]和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MSn)[2]檢測中藥所含的菲類成分，但是，這兩種測試手段操作相對繁瑣、儀器要求高、價(jià)格昂貴，不適合廣泛應(yīng)用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法能夠快速、準(zhǔn)確、簡便地測定龍須草中厄弗酚和去氫厄弗酚的含量，此方法所提供的客觀指標(biāo)為龍須草藥材的質(zhì)量評價(jià)提供了應(yīng)用依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡鷹,陸瑜,吳玉蘭,等.龍須草化學(xué)成分研究[J].中藥材,2014,37(4):602-604.

[2]趙丹丹,李貴云,王小紅,等.燈心草及野燈心草中菲類成分的LC-ESI-MS快速識別及鑒定[J].中草藥,2013,44(12):1539-1545.

[3]李軍,時(shí)圣明,孫玉坤,等.龍須草中1個(gè)新的二氫菲類化合物[J].中草藥,2015,46(16):2361-2364.

[4]Wang J,Liu J,Wen QF,et al.Chemical constituents from the aerial parts of Juncus setchuensis[J].Biochem Syst Ecol,2010,38(5):1039-1041.

[5]Wang XY,Ke CQ,Tang CP,et al.9,10-Dihydrophenanthrenes and phenanthrenes from Juncus setchuensis[J].J Nat Prod,2009,72(6):1209-1212.

[6]Marina DG,Antonio F,Lorenzo M,et al.Cytotoxic 9,10-dihydrophenanthrenes from Juncus effusus L[J].Tetrahedron,1993,49(16):3425-3432.

[7]Katsuhito S,Masao T,Yoshinori A.Phenanthrene derivatives from the medullae of Juncus effusus[J].Phytochemistry,1991,30(9):3149-3151.

[8]Greca MD,Fiorentino A,Mangoni L,et al.9,10-Dihydrophenanthrene metabolites from Juncus effusus L[J].Tetrahedron Lett,1992,33(36):5257-5260.

[9]韓廣軒,黃尊動,王麥莉,等.8種產(chǎn)地白及中兩種菲類的含量比較[J].中國藥師,2011,14(12):1744-1745.

[10]侯慧靜,蔡仕寧,李瑞芳,等.UPLC法測定石仙桃中的兩個(gè)二氫菲類化合物[J].華西藥學(xué)雜志,2015,30(4):493-494.

[11]付茜,孫璐,王勤輝,等.野燈心草地上部分菲類化合物的研究[C].中華中醫(yī)藥學(xué)會第七次中藥分析學(xué)術(shù)交流會論文集,2014:386-388.

Simultaneous content determination of two phenanthrene components inJuncussetchuensisby HPLC

LI Jun1,2,SUN Yu-kun3,SUN Yun-feng1,2,LIU Li1,2,FAN Ying1,2,ZHANG Li-de2*

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;2.Key Laboratory of Ministry of Education for TCM Viscera-State Theory and Applications,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;3.Department of Pharmacy,Liaoning Provincial Crops Hospital,Chinese People′s Armed Police Force,Shenyang 110034,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of effusol and dehydroeffusol in Juncus setchuensis.MethodsThe Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) column was used with methanol (A)-0.1% formic acid solution (B) gradient elution as the mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min,and the detection wavelength was at 260 nm with column temperature of 25 ℃.ResultsThe linear range of effusol and dehydroeffusol was 1.92～48.00 μg (r=0.999 5) and 4.13～103.25 μg (r=0.999 3),and the average recovery rates were 100.06% (RSD=0.91%,n=6) and 99.89% (RSD =1.35%,n=6).ConclusionThe established HPLC method is simple,rapid and reliable for the separation and simultaneous determination of effusol and dehydroeffusol,which provides a basis for quality evaluation for Juncus setchuensis as medicinal materials.

Key words：Juncus setchuensis;Phenanthrene;Juncaceae;Effusol;Dehydroeffusol

收稿日期：2015-10-30

基金項(xiàng)目：中國博士后科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(2015M570257)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606025

寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟象理論及應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110032；3.武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，沈陽 110034