李曉倩，方　波，馬　虹

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鞘內(nèi)注射右美托咪定增加神經(jīng)元自噬改善大鼠脊髓缺血再灌注損傷后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能

李曉倩，方波，馬虹*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001

[摘要]目的觀察注射右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)預(yù)處理對(duì)在體大鼠脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)后神經(jīng)元自噬和下肢運(yùn)動(dòng)功能的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為4組(每組30只)：假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注損傷組(IR組，鞘內(nèi)注射30 μL生理鹽水)、Dex組(缺血前3 d鞘內(nèi)注射右美托咪定10 μg/30 μL)、Dex+ATIP組(缺血前3 d鞘內(nèi)注射10 μg右美托咪定+10 μg阿替美唑共30 μL)。Sham組僅暴露主動(dòng)脈弓而不結(jié)扎，其他各組開胸后無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉主動(dòng)脈弓14 min后再開放，建立SCIRI模型。各組手術(shù)前均于L5-6鞘內(nèi)置管并連續(xù)注射3 d。損傷后48 h內(nèi)每12 小時(shí)取5只大鼠，采用Tarlov法評(píng)價(jià)大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能；HE染色觀察和計(jì)數(shù)損傷后48 h脊髓前角神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量；Western blot和RT-PCR法測(cè)定損傷后48 h大鼠脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3蛋白及mRNA含量。結(jié)果與Sham組比較，術(shù)后各觀察點(diǎn)IR組下肢運(yùn)動(dòng)功能明顯受損，Tarlov評(píng)分下降，脊髓組織中Beclin1、LC3蛋白及mRNA的表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；損傷前3 d鞘內(nèi)注射10 μg DEX(Dex組)可改善缺血再灌注損傷后下肢運(yùn)動(dòng)功能，提高Tarlov評(píng)分，改善脊髓Beclin1、LC3 mRNA蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而Dex+ATIP組與IR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。損傷后48 h，HE染色顯示，Sham組脊髓前角神經(jīng)元輪廓清晰，結(jié)構(gòu)完整，無出血、水腫等異常表現(xiàn)；IR組、Dex+ATIP組細(xì)胞質(zhì)中的尼氏體消失，神經(jīng)元胞核出現(xiàn)固縮或溶解，廣泛空泡形成；而Dex組神經(jīng)元形態(tài)明顯規(guī)整，且正常神經(jīng)元數(shù)量增多。結(jié)論鞘內(nèi)注射右美托咪定預(yù)處理通過上調(diào)Beclin1、LC3蛋白和基因表達(dá)，增加神經(jīng)元自噬，改善大鼠缺血再灌注后下肢運(yùn)動(dòng)功能。

[關(guān)鍵詞]鞘內(nèi)注射；右美托咪定；自噬；Beclin1；LC3

0引言

脊髓缺血再灌注損傷(Spinal ischemia reperfusion injury，SCIRI)在臨床常見于脊柱手術(shù)、動(dòng)脈瘤手術(shù)、血管畸形手術(shù)以及心臟手術(shù)體外循環(huán)期間等，損傷平面以下感覺和運(yùn)動(dòng)缺失，引起四肢癱瘓、截癱，甚至死亡，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，造成巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[1-3]。目前SCIRI病理學(xué)機(jī)制研究已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的難題和熱點(diǎn)。如何有效地防治和最大限度地降低圍術(shù)期SCIRI的發(fā)生率，保護(hù)神經(jīng)功能，降低術(shù)后并發(fā)癥，對(duì)改善患者的生存質(zhì)量和降低醫(yī)療成本，均具有重要意義。自噬(Autophagy)是亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程。近年研究表明，自噬現(xiàn)象廣泛存在于腦缺血、腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，參與并影響了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程[4-5]。正常情況下，自噬處于一個(gè)低水平表達(dá)的狀態(tài)；但當(dāng)某些病理情況下，如缺血缺氧時(shí)，自噬可被迅速激活，通過平衡細(xì)胞合成和分解代謝，維持缺血再灌注后細(xì)胞的存活[6-7]。目前自噬在SCIRI領(lǐng)域的相關(guān)研究甚少。

右美托咪定(Dexmedetomidine，Dex)是一種新型高選擇性腎上腺素能受體(α2AR)激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮等作用[8]。越來越多的研究證實(shí)，全身和鞘內(nèi)注射右美托咪定可抑制脊髓感受傷害性反應(yīng)，激活神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)保護(hù)信號(hào)通路，具有神經(jīng)修復(fù)作用[9-10]。本研究旨在觀察鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)SCIRI后大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能、脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和微管相關(guān)蛋白1的輕鏈(LC3)表達(dá)的影響[11]。

1儀器與試藥

雄性Sprague-Dawley大鼠120只，體重250～280 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。HE染液套盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；兔抗Beclinl多克隆抗體，兔抗LC3單克隆抗體(購自武漢博士德)；One step RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)；圖像分析系統(tǒng)(武漢華海公司，HIPAS-1000型)；酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司，EIx800型)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組大鼠隨機(jī)分為4組，每組30只。非假手術(shù)組參照文獻(xiàn)[2-3]制備脊髓缺血再灌注模型，并行L5-6鞘內(nèi)置管。假手術(shù)組(Sham組)：脊髓缺血前3 d鞘內(nèi)注射生理鹽水30 μL；缺血再灌注損傷組(IR組)：同Sham組；鞘內(nèi)右美托咪定預(yù)處理組(Dex組)：缺血前3 d鞘內(nèi)注射10 μg DEX (30 μL)；Dex+ATIP組：缺血前3 d鞘內(nèi)注射右美托咪定10 μg+阿替美唑10 μg(共30 μL)。1次/d，連續(xù)3 d。

2.2大鼠SCIRI模型的建立[2-3]水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，常規(guī)消毒，右側(cè)臥位，四肢固定于手術(shù)臺(tái)上，胸背部去毛，消毒鋪巾。沿肋緣切口逐層分離并暴露左肺上葉，面紗條肺部保護(hù)后由心包處開始分離主動(dòng)脈，至主動(dòng)脈弓左鎖骨上動(dòng)脈發(fā)出處上無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉14 min，之后撤除動(dòng)脈夾，逐層縫合傷口。腹腔注射0.3 mL氨芐青霉素(100 mg/mL)。術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

2.3神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)以改良的Tarlov評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)下肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。0分：沒有可覺察的下肢活動(dòng)；1分：有可覺察的關(guān)節(jié)自主活動(dòng)；2分：后肢可自由活動(dòng)，但無法站立；3分：可站立，但無法行走；4分：后肢功能完全恢復(fù)，能正常行走。

2.4脊髓組織病理學(xué)檢查(HE染色)完成神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后處死大鼠，切除L3-4椎板，暴露L5-6節(jié)段硬膜囊，切斷周圍神經(jīng)根；分離脊髓組織，10%甲醛固定48 h，分節(jié)段石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)目，觀察神經(jīng)元損傷情況。

2.5Western blot測(cè)定大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3的蛋白表達(dá)提取組織蛋白質(zhì)樣品，電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別加入兔抗LC3單克隆抗體(1∶500)、兔抗Beclinl多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃過夜，洗膜后再用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG雜交，37 ℃ 2 h，ECL試劑X線膠片顯像，掃描，以與β-actin的比值作為表達(dá)強(qiáng)度。

2.6RT-PCR測(cè)定大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3的mRNA表達(dá)按試劑盒說明書操作。通過1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)提取總RNA的質(zhì)量和濃度。引物序列如下：Beclin1：5′-GACCGAGTGACCATTCAGGAAC-3′(正向)，5′-GGTTCTCCATGGTGCCACCATCAG-3′(反向)；LC3：5′-GCACCATGCCGTCGGAGAAGACC-3′(正向)，5′-CACTCCTAGGTGGGAACACTACTG-3′(反向)；GAPDH：5′-TCGGCATTGTGGAGGGGCTC-3′(正向)，5′-TCCCGTTCAGCTCGGGGATG-3′(反向)。在FTC2000型熒光定量PCR儀上行PCR。擴(kuò)增條件如下：①94 ℃1 min，②94 ℃10 s，③55 ℃30 s，④72 ℃1 min，45個(gè)循環(huán)。退火期為55 ℃ 30 s。結(jié)束后，系統(tǒng)根據(jù)各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度增長指數(shù)(DRn)繪制擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，確定至特定闡值時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，采用2-△△CT法處理數(shù)據(jù)。

3結(jié)果

3.1神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)與Sham組比較，其余三組大鼠術(shù)后各觀察點(diǎn)(尤以48 h為著)Tarlov評(píng)分均明顯降低(P<0.05)；與IR組比較，Dex組各時(shí)間點(diǎn)Tarlov評(píng)分明顯升高(P<0.05)；Dex+ATIP組與IR組各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1　缺血再灌注后大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能(Tarlov評(píng)分)變化(n=6)

3.2對(duì)脊髓組織結(jié)構(gòu)的影響光鏡下觀察損傷后48 h脊髓組織病理變化，可見Sham組脊髓前角神經(jīng)元輪廓清晰，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)中可見尼氏體，無出血、水腫等異常；IR組、Dex+ATIP組中神經(jīng)元胞體皺縮或溶解，胞質(zhì)中的尼氏體消失，廣泛空泡形成，炎性細(xì)胞浸潤，正常運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目明顯減少；Dex組神經(jīng)元外觀介于Sham組和IR組之間，可見神經(jīng)元極性變鈍，但結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，可見到尼氏體。各組脊髓缺血再灌注損傷程度和脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)目計(jì)數(shù)見圖2。

圖2　鞘內(nèi)注射DEX對(duì)SCIRI導(dǎo)致脊髓組織病理變化和前角正常神經(jīng)元計(jì)數(shù)(400×)

3.3Western blot測(cè)定脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的含量與Sham組比較，術(shù)后48 h，IR組大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Dex組中表達(dá)明顯增加(P<0.05)；而IR組和Dex+ATIP組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

3.4RT-PCR法測(cè)定脊髓組織中Beclin1和LC3 mRNA的含量與Sham組比較，術(shù)后48 h，IR 組大鼠脊髓組織中Beclin1和LC3 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Dex組中表達(dá)明顯增加(P<0.05)；而IR組和Dex+ATIP組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

4討論

SCIRI是指短暫缺血脊髓在恢復(fù)血液再灌注后，組織細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)功能破壞反而加重的現(xiàn)象。炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元凋亡是SCIRI的主要特征[2-4,12]。DEX是新一代α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，通過激動(dòng)腦干藍(lán)斑，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛以及抑制交感興奮、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，在臨床中廣泛應(yīng)用。最近研究發(fā)現(xiàn)，DEX在腦和心肌缺血再灌注損傷中可以通過降低血漿中兒茶酚胺的濃度、抑制凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13-14]。但對(duì)其在SCIRI的神經(jīng)保護(hù)作用的研究較少。越來越多的研究表明，全身和鞘內(nèi)注射右美托咪定可抑制脊髓感受傷害性反應(yīng)和激活神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)保護(hù)信號(hào)通路，具有神經(jīng)修復(fù)作用[9-10]。因此，本研究通過鞘內(nèi)注射DEX，觀察其對(duì)SCIRI后下肢運(yùn)動(dòng)功能的影響，探討其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制。

圖3　Weston blot測(cè)定脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)

圖4　RT-PCR測(cè)定脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3 mRNA

無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉主動(dòng)脈弓模擬SCIRI是目前應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物模型之一，具有高度的重復(fù)性[2-3,9]。本實(shí)驗(yàn)觀察顯示，IR組大鼠術(shù)后各觀察點(diǎn)Tarlov評(píng)分較Sham組降低，提示SCIRI可以引起下肢運(yùn)動(dòng)功能障礙。本研究中，Tarlov評(píng)分在術(shù)后48 h降低最明顯，因此，選擇術(shù)后48 h對(duì)脊髓組織進(jìn)行病理學(xué)等的檢查。HE染色結(jié)果顯示，IR組神經(jīng)元形態(tài)缺失，炎癥和空泡化明顯，脊髓前角正常神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，而Dex組神經(jīng)元形態(tài)基本完好，提示運(yùn)動(dòng)功能下降與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，鞘內(nèi)注射DEX可以維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的形態(tài)和功能，且可被其特異性阻滯劑阿替美唑所抑制。

自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，通過自噬溶酶體進(jìn)行多種酶的消化及降解，維持細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)，凈化自身多余或受損細(xì)胞[4,7]。正常情況下，自噬處于一個(gè)低水平表達(dá)的狀態(tài)，適量自噬表達(dá)時(shí)，自噬體數(shù)量處于溶酶體的降解能力范圍內(nèi)，此時(shí)自噬的主要功能是為細(xì)胞提供能量，促進(jìn)細(xì)胞存活[4,15]。病理情況下，細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷濃度迅速下降，引起單磷酸腺苷激活的蛋白激酶促進(jìn)自噬形成，維持細(xì)胞功能[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與腦缺血性和出血性疾病過程，影響了神經(jīng)細(xì)胞的生存和死亡，且自噬途徑的激活可能是缺血損傷早期的一種潛在的保護(hù)機(jī)制[7]。Beclin1和LC3是自噬相關(guān)的標(biāo)記蛋白。Beclin1可以參與自噬體的形成，調(diào)節(jié)其他自噬蛋白在自噬前體膜的定位，是維持自噬/凋亡負(fù)反饋平衡的關(guān)鍵[16]，而LC3Ⅱ則直接反映自噬發(fā)生程度[7]。本實(shí)驗(yàn)從蛋白和核酸水平證實(shí)，損傷后48 h，與Sham組比較，IR組Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)下降，而Dex組LC3Ⅱ表達(dá)明顯上升，提示鞘內(nèi)注射DEX可以誘導(dǎo)自噬發(fā)生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，與郭倩等[17]研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究通過觀察鞘內(nèi)注射右美托咪定對(duì)SCIRI模型中大鼠行為學(xué)、脊髓病理學(xué)、Beclin1和LC3蛋白、基因表達(dá)的影響，證實(shí)SCIRI損傷中可能存在自噬途徑，鞘內(nèi)注射DEX可以通過提高自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達(dá)，提高Tarlov評(píng)分，改善下肢運(yùn)動(dòng)功能，揭示Dex對(duì)SCIRI發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的潛在新機(jī)制，為臨床改善脊髓損傷預(yù)后提供了新的治療靶點(diǎn)。

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Intrathecal injection with dexmedetomidine to improve neural motor function in rats with spinal cord ischemia reperfusion injury

LI Xiao-qian,FANG Bo,MA Hong*

(Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of intrathecal injection with dexmedetomidine on neuropathic autophagy and lower extremities motor function in rat model of spinal cord ischemia reperfusion injury (SCIRI).MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups(n=40):Sham group,IR group,Dex group and Dex+ATIP group.The NS 30 μL,DEX 10 μg (30 μL) and DEX 10 μg+atipamezole 10 μg (30 μL)was administered intrathecally for 3 d before surgery in IR group,Dex group and Dex+ATIP group,respectively.The lumbar intrathecal catheters were implanted in L5-6of rats and SCIRI models were established by aortic arch occlusion for 14 min.The lower extremities motor function was assessed by Tarlov scores.HE staining was performed for observing the neuronal morphology and counting the number of normal neurons in anterior horn of injured spinal cord at 48 h after IR.The spinal mRNA and protein expressions of Beclin1 and LC3 were assessed by Western blot and real-time PCR.ResultsCompared with Sham group,the lower extremities motor function in IR group was injured,and the Tarlov scores were decreased with lower expression of mRNA and protein of Beclin1and LC3 in spinal cord at 48 h after injury.Intrathecal injection with dexmedetomidine(Dex group) could increase the Tarlov scores,and improve the lower extremities motor function after ischemia reperfusion injury and the expression of mRNA and protein of Beclin1 and LC3 in the spinal cord(P<0.05),while no significant difference was observed between Dex+ATIP group and IR group.HE staining showed that Sham group had clear outline and complete structure of spinal cord anterior horn motor neurons without abnormal appearance of bleeding or edema at 48 h after IR injury.The Nissl substance in IR group and Dex+ATIP group disappeared with condensation or dissolution in nucleus of neurons and wide cytoplasmic vacuolating formation.The shape of neuron in Dex group was clear,and the number of normal neuron increased.ConclusionIntrathecal injection with dexmedetomidine can enhance the neuron autophagy,improve the lower extremities motor function after ischemia reperfusion injury by up-regulating the expression and protein of Beclin1 and LC3 in spinal cord.

Key words：Intrathecal injection;Dexmedetomidine;Autophagy;Beclin1;LC3

收稿日期：2016-01-14

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2012408002)；國家自然科學(xué)基金(81271370)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201606002