韓　偉，汪佳丹，徐　婷

(華東理工大學 藥學院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上?！?00237)

?

Folin-Ciocalteu法測定金針菇多酚的條件優(yōu)化

韓偉，汪佳丹，徐婷

(華東理工大學 藥學院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237)

摘要：采用Folin-Ciocalteu法測定金針菇多酚，在單因素基礎上，利用二次正交旋轉組合設計，優(yōu)化測定金針菇多酚含量的條件.結果表明，利用Folin-Ciocalteu法測定金針菇多酚含量的最佳條件：添加2 mL的福林酚試劑以及2.4 mL的15% Na2CO3溶液，反應時間為70 min，溫度45 ℃，測定波長為730 nm.

關鍵詞：金針菇；多酚；Folin-Ciocalteu法；二次正交旋轉組合設計

金針菇(Flammulinavelutipes)隸屬于真菌界(Eumycophyta)，為菌藻地衣類[1]，其性寒、味咸、滑潤，歸肝、胃、腸三經(jīng)，具有利肝臟、益腸胃、增智慧和抗癌瘤等功效，食用和藥用價值較高[2].金針菇活性成分的研究多集中于多糖類物質，而其所含多酚化合物的相關報道較少，因植物多酚是一類強活性的可再生資源，具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、提高免疫力等多種藥理功效[3]，研究開發(fā)金針菇多酚具有一定的理論意義和實用價值.

目前，植物多酚的測定方法主要有高錳酸鉀法、福林酚法(Folin-Ciocalteu method,FC法)、紫外分光光度法、普魯士藍法、酒石酸亞鐵法、香草醛鹽酸法等[4].因Folin-Ciocalteu法對儀器設備要求低，靈敏度及穩(wěn)定性高，操作簡便快速，在植物多酚含量測定的應用上最為普遍，但對于不同供試品的測定，F(xiàn)olin-Ciocalteu法的顯色條件會有所差異[5-6]，即某顯色條件體系對特定植物供試品顯色靈敏而穩(wěn)定，但運用于另一種植物多酚含量測定時卻達不到應有的效果，這可能與不同植物所含多酚種類相關[7].本文考察了Na2CO3溶液質量分數(shù)和用量、福林酚試劑用量以及顯色溫度和時間對金針菇多酚顯色后吸光度值的影響，并采用二次正交旋轉組合設計對影響較大的顯色條件進行參數(shù)優(yōu)化，以期建立靈敏、穩(wěn)定、準確且高效的測定金針菇多酚含量的Folin-Ciocalteu法，旨在為金針菇多酚提取純化等工藝研究和進一步的開發(fā)利用提供參考.

1材料與方法

1.1材料與試劑

金針菇(鮮品)購自上海雪榕生物科技股份有限公司，自然陰干至恒重，避光保存?zhèn)溆?；沒食子酸對照品(質量分數(shù)≥99%)，J&K chemical百靈威科技有限公司；福林酚試劑，上海荔達生物科技有限公司；去離子水，上海華震科技有限公司；95%乙醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉(分析純)，上海凌峰化學試劑有限公司.

1.2主要儀器與設備

AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；ER-692型微波提取裝置，中國電子器件工業(yè)總公司；多功能高速粉碎機，江西贛云食品機械有限公司；UV1900PC型紫外-可見分光光度計，上海亞研電子科技有限公司；RJ-TGL-16C型臺式高速離心機，無錫市瑞江分析儀器有限公司.

1.3金針菇多酚供試液的制備

準確稱取80目金針菇干粉3.0 g于250 mL三口燒瓶中，加入50 mL70%乙醇溶液，輕搖至藥材浸潤，置于微波提取裝置間歇提取3 min，于冷水浴中冷卻后減壓抽濾，相應溶劑定容于50 mL棕色容量瓶中，搖勻，6000 r/min離心8 min，即得金針菇多酚供試液.

1.4Folin-Ciocalteu法測定流程

精密移取適量供試液于25 mL棕色容量品中，依次加入2.0 mL去離子水和一定體積福林酚試劑，靜置3 min后再加入Na2CO3溶液，迅速用去離子水定容至刻度，混勻后水浴靜置一段時間，以去離子水作空白參比，在檢測波長處測定并記錄吸光度值，平行測定3次[8].

1.5檢測波長的確定

分別移取適量對照品溶液和供試品溶液于25 mL棕色容量瓶中，按照1.4中測定方法依次加入試劑進行顯色，用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描；同樣條件下取適量對照品溶液和供試品溶液不加顯色劑進行全波長掃描，記錄掃描數(shù)據(jù).

1.6條件優(yōu)化試驗

1.6.1單因素試驗設計

分別單獨考察Na2CO3質量分數(shù)(2%，3.5%，5%，7.5%，10%，12.5%，15%，17.5%，20%)、Na2CO3溶液用量(0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL)、福林酚試劑用量(0.2，0.5，0.8，1.1，1.4、1.7，2.0，2.3 mL)、顯色溫度(25，35，45，55，65 ℃)和顯色時間(15，30，45，60，75，90，105，120，135，150 min)對金針菇多酚顯色后吸光度值的影響.單因素試驗條件如表1所示.

表1　單因素試驗條件

1.6.2二次正交旋轉組合試驗設計

綜合單因素試驗結果，以福林酚試劑用量(X1)、15%Na2CO3溶液用量(X2)以及顯色時間(X3)三個影響較大的因素進行試驗設計并確定相應零水平值.以吸光度值(Y)作為響應值，采用二次正交旋轉組合設計試驗對顯色條件進行優(yōu)化.試驗相關參數(shù)[9]：自變量p=3；二水平正交試驗點mc=23=8；組合的星號臂值γ=2p/4=1.681 79且星號點試驗共2p=6；由二次正交組合設計參數(shù)表查得，中心試驗點m0=9，總試驗數(shù)N=mc+2p+m0=23組.試驗因素水平值及編碼見表2.

表2　三元二次正交旋轉組合設計因素水平編碼表

2結果與分析

2.1最佳檢測波長

比較對照品溶液與供試品溶液顯色及不顯色紫外可見光譜圖(如圖1)，可以看出金針菇多酚在顯色與未顯色情況下，均與沒食子酸對照品溶液相同處理后的全波長掃描光譜圖相一致.在顯色反應后，供試液和對照品溶液在可見光區(qū)有一較為平緩的吸收峰，在730 nm處吸光度值最強，相比下未加顯色劑的供試液及對照品溶液在可見光區(qū)不存在吸收，因此其他非目標組分在可見光區(qū)對多酚含量測定的干擾性小，選擇730 nm作為Folin-Ciocalteu法的最佳檢測波長.

2.2Folin-Ciocalteu法條件優(yōu)化結果

2.2.1單因素試驗

1)Na2CO3質量分數(shù)

測定中，多酚要被福林酚試劑氧化，需在弱堿性條件下解離成酚鹽離子，當顯色體系pH值與酚類pKa值相近時，多酚離子化程度大，反應迅速且完全[10]，Na2CO3被用于調(diào)節(jié)比色體系的酸堿環(huán)境，不同質量分數(shù)Na2CO3溶液的顯色效果也不一.由圖2及實驗現(xiàn)象可知，Na2CO3質量分數(shù)小于5%時，顯色液呈草綠色，顯色效果不佳，當質量分數(shù)超過5%時，顯色液呈深藍色，吸光度值緩慢增大，質量分數(shù)為15%時吸光度值達到最大值，后呈下降趨勢，考慮到高質量分數(shù)Na2CO3溶液易析出晶體從而影響分析，選擇Na2CO3質量分數(shù)為15%.

2)Na2CO3溶液用量

圖3為Na2CO3溶液用量對金針菇多酚顯色后吸光度值的影響.由圖可見：隨著碳酸鈉溶液用量的增加，吸光度呈先增大后降低趨勢，當用量達到2 mL時吸光度值(0.4679)最大，說明顯色反應比較完全；用量超過2 mL，堿性過強影響反應，吸光度值下降.綜上，15%Na2CO3溶液用量選為2 mL.

圖2　Na2CO3質量分數(shù)對金針菇多酚顯色后吸光度值的影響

圖3　Na2CO3溶液用量對金針菇多酚顯色后吸光度值的影響

3)福林酚試劑用量

福林酚試劑作為顯色劑，其用量對顯色效果影響較大，如圖4所示.隨福林酚試劑用量增加，金針菇多酚顯色后吸光度值呈先上升后降低趨勢.當福林酚試劑用量為1.7 mL時，顯色效果最好，再增加福林酚試劑用量，吸光度值下降，這可能是由于過大加入量使顯色反應體系不穩(wěn)定所造成的.因此，福林酚試劑用量選擇為1.7 mL.

圖4　福林酚試劑用量對金針菇多酚顯色后吸光度值的影響

4)顯色溫度和時間

在一定溫度下，供試液顯色完全需一定時間，而升高溫度可加速反應，促進特異性有色物質生成，且溫度越高，達到最大吸光度值的時間越短.但溫度過高將導致多酚類物質或顯色生成物被破壞；而溫度過低顯色反應進行緩慢且顯色不充分，均影響測定結果[11].

圖5為溫度和時間對多酚顯色后吸光度值的影響結果，分析圖5可知，溫度低時顯色緩慢，相同顯色時間下吸光度值較??；溫度較高時，顯色迅速，但吸光度值隨時間降低也較快，表明顯色體系在高溫下穩(wěn)定性差.在25 ℃和35 ℃下，吸光度值隨時間呈上升趨勢，但在測定的150 min內(nèi)還未達到最大吸光度值；在55 ℃和65 ℃下，約顯色30 min，吸光度值即可達到最大，但其隨時間降低的趨勢也顯著；45 ℃條件下的顯色曲線最符合測定要求，反應進行到105 min時，吸光度值已趨于平穩(wěn)，且在隨后測定的45 min內(nèi)保持穩(wěn)定.

圖5　溫度和時間對多酚顯色后吸光度值的影響

2.2.2二次正交旋轉組合試驗結果

1)試驗方案及數(shù)據(jù)結果

綜合單因素試驗結果，選擇對顯色影響較大的因素——福林酚試劑用量(X1)、15%Na2CO3溶液用量(X2)及顯色時間(X3)，采用二次正交旋轉組合試驗對條件參數(shù)進行優(yōu)化，試驗方案及數(shù)據(jù)結果見表3.

表3　三元二次正交旋轉組合設計方案及結果分析

優(yōu)化設計共有23個試驗點，其中，1～8號為兩水平正交試驗，9～14號為星號點處試驗，中心點試驗為15～23號，用以估計試驗誤差.

2)模型建立與方差分析

表4　回歸模型方差分析

3)模型各項顯著性檢驗

表5顯著性檢驗結果表明，一次項中Na2CO3溶液用量對模型影響極顯著(P<0.01)，顯色時間影響顯著(P<0.05)，說明這兩者為顯色測定中的關鍵因素；福林酚試劑用量和Na2CO3溶液用量的交互項影響極顯著(P<0.01)，Na2CO3溶液用量和顯色時間交互項影響顯著(P<0.05)，表明顯色各因素間存在交互作用影響，不呈簡單線性關系.通過比較模型一次項系數(shù)絕對值的大小來判斷3個因素對金針菇多酚顯色效果影響的主次性順序為：Na2CO3溶液用量>顯色時間>福林酚試劑用量.

表5　回歸模型各項顯著性檢驗

4)單因子效應分析

由于二次正交旋轉組合試驗滿足正交設計要求，模型中各效應項可線性相加，偏回歸系數(shù)彼此獨立，可采用“降維法”進行分析[12]，即將回歸方程中任意兩因素固定于零水平，得到另一因素對吸光度值影響的關系曲線，如圖6所示.圖中，曲率幅度直觀表現(xiàn)了各因素對多酚顯色效果的影響程度，吸光度值隨Na2CO3溶液用量的變化幅度最大，影響最顯著，其次為顯色時間，這與模型顯著性檢驗結果相一致.

圖6　單因子效應分析圖

5)雙因子交互作用分析

固定回歸模型任一變量于零水平，由SAS 9.0軟件處理另兩變量間交互作用關系得等高線圖及響應面圖，如圖7～9所示.等高線圖及響應面圖可直觀反映兩因素間交互作用的顯著程度，等高線圖中橢圓越扁平，兩因素間的交互作用越顯著，而在響應面圖中，單一因素軸向的曲面越陡峭，曲率半徑越大，則這一因素對響應值的影響越顯著，并且在因素不同水平值下，另一因素的響應值變化程度的不同表明兩者間交互作用顯著.

在圖7和圖9中，X1X2和X2X3的等高線圖呈扁平橢圓形，響應面圖中，兩兩因素間在不同水平值下，響應值的變化程度不同，如X1X2響應曲面圖中，當X1處于低水平時，響應值隨X2的增大呈先增大后減小趨勢，而X1處于高水平時，響應值隨X2顯著升高后呈小幅下降，這些變化均說明X1和X2以及X2和X3間的交互作用顯著，而X1X3等高線圖近乎圓形，表明交互作用不顯著.

圖7　福林酚試劑用量(X1)與Na2CO3溶液用量(X2)的交互作用

圖8　福林酚試劑用量(X1)與顯色時間(X3)的交互作用

圖9　Na2CO3溶液用量(X2)與顯色時間(X3)的交互作用

根據(jù)響應面圖中因素軸向曲面的陡峭程度進行判斷可知，3個因素對顯色效果的影響由大到小依次為：Na2CO3溶液用量>顯色時間>福林酚試劑用量.模型直觀分析結果與顯著性檢驗結果一致，進一步說明了各因素間的交互作用關系.

6)最佳顯色條件的確定及驗證

利用SAS 9.0軟件對回歸模型進行典型分析模擬尋優(yōu)，得到最佳顯色條件理論值，即經(jīng)典型分析后得到一個穩(wěn)定點以及最大臨界響應值，如表6所示.

表6　回歸模型典型分析

根據(jù)理論顯色條件進行驗證試驗，考慮到實際可操作性，將驗證顯色參數(shù)微調(diào)為：福林酚試劑用量2 mL，15% Na2CO3溶液用量2.4 mL，時間70 min，驗證所得吸光度值為0.6564±0.0059(n=3)，比表5中的最大理論值低1%，重復試驗相對標準偏差小于2%，說明實際值與理論值相接近，該模型可較好模擬顯色條件對金針菇多酚顯色效果的影響，優(yōu)化結果可用于實際含量測定.

3結語

1)經(jīng)二次正交旋轉組合設計對金針菇多酚顯色條件進行優(yōu)化，所得方差分析結果表明：模型擬合極顯著(P<0.0001)，失擬項影響不顯著(P>0.05)，說明所得回歸模型對試驗結果擬合度高，能代替真實試驗點進行分析.由模型各項顯著性檢驗結果結合單、雙因子效應分析圖譜可知，各因素對顯色效果影響的主次性順序為：Na2CO3溶液用量>顯色時間>福林酚試劑用量，并且因素間存在一定交互作用，不呈簡單線性關系.

2)由SAS 9.0軟件對模型進行典型分析并經(jīng)試驗驗證后得到最佳顯色參數(shù)為：福林酚試劑用量2 mL，Na2CO3溶液用量2.4 mL，時間70 min.在此條件下金針菇多酚顯色后吸光度值最大，可達0.6564±0.0059(n=3)，以此提高測定靈敏度.

參考文獻：

[1] 吳興亮,卯曉嵐,圖力古爾,等.中國藥用真菌[M].北京:科學出版社,2013:1-10,306.

[2] 楊瑞長,劉康乾.食用菌保健功能與食療方[M].北京:金盾出版社,2000:4-17,124.

[3] 姚瑞祺.植物多酚的分類及生物活性的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊),2011(4):99-100.

[4] 石碧,狄瑩.植物多酚[M].北京:科學出版社,2000.

[5] 李寶偉,孫曉華.淺析金針菇價值與培育[J].農(nóng)業(yè)與技術,2014(6):146.

[6] 張梅梅,魏志文,劉玉冰,等.Folin-Ciocalteu比色法測定樺褐孔菌多酚的條件優(yōu)化[J].菌物學報,2011,30(2):295-304.

[7] 向莉,王琪,徐遠陽,等.Folin-Ciocalteu法測定黑粒小麥麩皮中多酚含量的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2012(1):57-60.

[8] SINGLETON V L,OTTHOFER R,LAMUELA-RAVENTOS R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J].Methods in Enzymology,1999,229(14):152-178.

[9] 上海師范大學數(shù)學系概率統(tǒng)計教研組.回歸分析及其實驗設計[M].上海:上海教育出版社,1978.

[10] 徐國前,欒麗英,焦旭亮,等.測定葡萄與葡萄酒總酚的二次回歸正交旋轉優(yōu)化設計[J].果樹學報,2011,28(3):531-535.

[11] 張梅梅,魏志文,劉玉冰,等.Folin-Ciocalteu比色法測定樺褐孔菌多酚的條件優(yōu)化[J].菌物學報,2011,30(2):295-304.

[12] 徐靜,張井,李燕,等.二次回歸正交旋轉組合設計在鳀魚蒸煮液酶解工藝中的應用研究[J].食品科學,2009,30(22):221-225.

(編輯崔思榮)

Optimization on Determination Conditions of Polyphenol in

FlammulinVelutipesby Folin-Ciocalteu Method

HAN Wei,WANG Jiadan,XU Ting

(Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,School of pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Abstract:The total polyphenol in Flammulina velutipes was determined by Folin-Ciocalteu method,and the stuitable chromogenic conditions for determination were optmized by quadratic orthogonal rotation combination design which was based on the single-factor experiments.Results showed that the optimum chromogenic conditions were as follows:2 mL Folin phenol reagent,2.4 mL 15% Na2CO3 at 45 ℃ for 70 min,and the detection wavelength was 730 nm.

Key words:Flammulina velutipes; total polyphenol; Folin-Ciocalteu method; quadratic orthogonal rotation combination design

收稿日期：2016-03-20

基金項目：國家自然科學基金資助項目(20006003);上海市科技興農(nóng)重點攻關項目[滬農(nóng)科攻字(2012)第2-9號]

作者簡介：韓偉(1968-)，男，教授，博士，博士生導師，主要從事天然產(chǎn)物的提取、分離及功能研究.

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1674-358X(2016)02-0026-09