王楷宬，邱 源，莊青葉，張笑春，王　通，陳繼明

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

?

高通量測序分析1株H7N9流感病毒的全基因

王楷宬，邱 源，莊青葉，張笑春，王通，陳繼明

（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

摘要：為探索利用高通量測序開展H7N9亞型流感的監(jiān)測、全基因分析和溯源研究的方法，使用Ion Torrent PGM測序儀對1株H7N9流感病毒進行了全基因測序，分析了此毒株的基因組特性和進化特征。結果顯示，該毒株與2013年引起我國華東地區(qū)疫情的H7N9流感毒株的親緣關系較近；縱觀在不同年代和地點分離的H7N9流感病毒的6個內部基因，2013年疫情之前和之后的H7N9流感病毒存在明顯差異。

關鍵詞：H7N9流感病毒；高通量測序；基因組；分子演化

資助項目：科技部科技基礎性專項（SQ2012FY3260033）；中國動物衛(wèi)生與流行病學中心創(chuàng)新基金（2015IF-0004FF）

H7N9 流感病毒屬于正粘病毒科、甲型流感病毒屬。與其他甲型流感病毒一樣，H7N9 流感病毒為有包膜、分節(jié)段、單負鏈RNA 病毒，基因組包括8 個片段。根據HA 和NA 抗原性的差異，甲型流感病毒可分為若干亞型，迄今已發(fā)現18種HA亞型（H1～H18）和11種NA亞型（N1～N11）[1-3]。任何一對HA 和NA 均可組合成一個亞型， 如H1N1、H5N1、H7N9等。

甲型流感病毒的宿主廣泛，在人類中流行的有H1N1、H2N2 和H3N2 亞型，禽類常感染H5N1、H5N9、H3N8、H9N2、H5N2和H6N5等亞型[4]。禽類攜帶的流感病毒偶爾可感染人類，現已證實能直接感染人類的禽流感病毒有H5N1[5]、H9N2[6]、H7N2[7]、H7N3[8]、H7N7[9]、H7N9[10]、H5N2[11]、H10N7[12]和H10N8[13]等。

自2013 年2 月19 日開始，我國東南部的上海、安徽等地陸續(xù)發(fā)現由甲型H7N9 流感病毒引起的人感染病例。全基因系統(tǒng)進化分析表明，此次引起人類感染的H7N9 流感病毒與以前在禽類中發(fā)現的H7N9流感病毒完全不同，是一種從未出現過的新型流感病毒[10]。分析H7N9流感病毒全基因，對了解H7N9流感病毒的遺傳演化關系，以及監(jiān)測該病毒的發(fā)生發(fā)展趨勢有重要意義。因此，本文采用高通量測序方法對1株在我國華東地區(qū)分離到的H7N9流感病毒進行了全基因測序與分析。

1　材料和方法

1.1材料和儀器

PathAmp FluA Reagent Kit、Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Batcode Aaptors、Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑，均購自Life technologies公司；超凈工作臺（美國Forma Scientifi c）；移液器（Eppendorf）；孵化器（德州誠信孵化設備有限公司）；高速臺式離心機（德國Heraeus Biofuge primoR）；PCR擴增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）。

1.2毒株

H7N9流感病毒株A/chicken/China/028/2014，由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心禽病監(jiān)測室保存，2014年1月分離自我國華東地區(qū)某活禽交易市場的雞拭子樣品，按農業(yè)行業(yè)標準（NY/T 772-2013）已鑒定為流感病毒H7N9亞型。

1.3流感病毒全基因擴增

按照說明書操作，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit （Qiagen，德國）提取病毒RNA。應用PathAmp FluA Reagent Kit對病毒 RNA進行反轉錄，并擴增生成全基因組cDNA。使用Qubit核酸濃度測定儀及配套試劑測定DNA濃度。

1.5文庫構建

將純化后的H7N9流感病毒全基因cDNA稀釋成35 μL含有200 ng DNA的溶液，使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit將病毒全基因組DNA打斷為200 bp的片段，并加入含有Barcode的接頭，構建為PGM測序儀可識別的DNA文庫。

1.6測序

將DNA文庫稀釋為26 pM，應用Ion PGM Template OT2 200 Kit對DNA文庫進行測序前的樣品處理。將處理后的樣品加樣至Ion 318 芯片，置于PGM測序儀進行測序。測序序列經PGM自帶的FluAnalysis（v4.0）軟件進行序列拼接。

1.7分析與毒力或宿主嗜性相關的關鍵位點

使用Lasergene軟件將A/chicken/China/028/ 2014的HA基因翻譯為蛋白質序列，分析HA蛋白的裂解位點（第333～341位氨基酸）序列[14]，以及第226位氨基酸是否由Gln替換為Leu[15]，分析NS蛋白中結合CPSF的特異性殘基是否為GLEWN[16]。

1.8分子進化分析

利用NCBI的Infl uenza Virus Resource數據庫，搜索并下載其收錄的，來自全球的H7N9亞型流感病毒全基因序列，在Linux 系統(tǒng)下，對同一時間、同一地點的毒株隨機各抽選1株，并將各株病毒的同一基因節(jié)段分別與測序得到的序列一起使用MEGA6.0[17]進行對齊，同時加入有關2013年H7N9毒株進化分析文章中[10，18-19]提及的來源毒株A/duck/Zhejiang/12/2011（H7N3）、A/brambling/Beijing/16/2012（H9N2）和A/Baikal teal/Hongze/14/2005 （H11N9）的基因節(jié)段。 采用此軟件計算得出構建進化樹的最佳運算模型，繪制系統(tǒng)進化樹。

2　結果與分析

2.1流感病毒全基因組擴增及文庫構建

使用PathAmp FluA Reagent Kit擴增出目的條帶，得到該病毒全基因的所有節(jié)段擴增產物，見圖1。純化后的cDNA濃度為49.1 ng/μL，經稀釋后構建成含有Barcode接頭的200 bp DNA文庫。

圖1　PathAmp FluA Reagent Kit擴增A/chicken/ China/028/2014的全基因

2.2測序質量與測序深度

測序數據已上傳至GenBank，登錄號為SRR2970480。該病毒經基因組測序共產生193 448個reads，其中有187 117個reads正確匹配到甲型流感病毒的序列上，覆蓋了流感病毒的所有8個節(jié)段。該毒株每個節(jié)段的平均測序深度見表1。包括各節(jié)段的5'和3'端序列在內的所有節(jié)段至少平均被測189次（PA基因）。NA基因的平均測序深度最大，為3 539。

表1　A/chicken/China/028/2014毒株各節(jié)段的測序深度

2.3與毒力或宿主嗜性相關的關鍵位點

該病毒HA蛋白的裂解位點（第333～341位氨基酸）序列為PEIPKGR↓GLF，為低致病性毒株。HA蛋白Q226為Leu，可緊密結合α-2和6 humanlike 受體，增加了通過空氣傳播的能力[15，20]。NS1蛋白能結合CPSF，其結合CPSF的特異性殘基為GLEWN。該毒株特異性殘基中的L突變?yōu)镕，即GLEWN 突變?yōu)镚FEWN，可能導致這些毒株致病力增強。

2.4病毒全基因分子進化分

該病毒8個節(jié)段的序列登錄號為：KU318986-KU31進化分析發(fā)現，其與2013年引起我國華東地區(qū)疫情的H7N9流感病毒相似。HA基因和NA基因與來源于浙江的H7N3 流感病毒A/duck/Zhejiang/12/2011（H7N3）和韓國野鳥中發(fā)現的H7N9 流 感 病 毒A/wild bird/Korea/A14/2011（H7N9）親緣關系近；PA、PB1、PB2和NP基因與來源于北京燕雀的H9N2 流感病毒株 A/ brambling/Beijing/16/2012 （H9N2）相近。該病毒的M基因、NS基因與2013年引起我國華東地區(qū)疫情的H7N9流感病毒存在一定的差異，其M基因與A/brambling/ Beijing/16/2012（H9N2）的同源性更高，NS基因與A/brambling/Beijing/16/2012 （H9N2）的親緣關系稍遠，均與2013年之后發(fā)現的，不同宿主的H7N9流感病毒同源。對不同時間、不同地區(qū)分離到的H7N9流感病毒的6個內部基因進行遺傳進化分析發(fā)現，2013年H7N9疫情發(fā)生前與發(fā)生后的異，H7N9流感病毒的6個基因節(jié)支（圖3）。僅1株2013年疫情uck/Zhejiang/LS02/2014（H7N9）其與2013年疫情之前的毒株親緣關系稍遠，與2014年疫情之后的毒株親緣關系稍近。

圖2　HA、NA基因分子進化分析

3　討論

2013年春，在我國華東地區(qū)，H7N9流感病毒引起多人感染和死亡。Gao等[10]認為引起此次疫情的病原是一種三源重配的新型H7N9流感病毒。該病毒所有基因片段均來源于禽流感病毒，不含任何人流感病毒的基因片段，并且該病毒的8個基因節(jié)段來源于3個不同的禽流感病毒株。其中HA 基因與2011 年在我國浙江分離到的H7N3禽流感病毒株A/duck/ Zhejiang/12/2011（H7N3）同源性最高，NA 基因與2011年在韓國野鳥中發(fā)現的H7N9 流感病毒株A/wild bird/ Korea/A14/2011（H7N9）高度同源，其余6個內部基因與2012年在北京燕雀中分離到的H9N2禽流感病毒株A/brambling/Beijing/16/2012 （H9N2）同源性最高。雖然各基因片段分別與近年在東亞地區(qū)流行的禽流感病毒相近，但這種基因片段的組成此前從未在禽、人或其他動物中發(fā)現過。Xiong等[19]認為NA基因并非來源于韓國的野鳥，而是來自于江蘇洪澤湖地區(qū)花臉鴨的H11N9 病毒A/Baikal teal/Hongze/14/2005（H11N9）。由于H7N9流感病毒為多源重配的新型流感病毒，且不同研究對其重組來源的分析結果不同，毒株的多樣性也不十分清晰，因而對H7N9亞型流感病毒監(jiān)測、全基因分析和溯源研究有重要意義。

圖3　病毒內部基因分子進化分析

本文采用Ion Torrent PGM高通量測序儀完成了1株H7N9流感毒株的全基因測序。結果顯示，本文所采用的建庫與測序方法能夠測定流感病毒的全基因，并且測序深度較大，能滿足序列分析的需要。本研究在一次測序中完成了該病毒全部8個基因的測序，能夠滿足對H7N9亞型流感監(jiān)測、全基因分析和溯源研究的要求。全基因序列遺傳進化分析發(fā)現，該病毒與2013年引起我國華東地區(qū)疫情的H7N9流感病毒的親緣關系較近。針對Gao[10]和Xiong[19]對引起2013年疫情毒株的NA基因來源的爭議，本文同時加入了A/wild bird/Korea/ A14/2011（H7N9）和A/Baikal teal/Hongze/14/2005（H11N9）兩株病毒進行分析，結果發(fā)現本文測序的毒株和引起2013年疫情毒株的NA基因均與A/ wild bird/Korea/A14/2011（H7N9）相近，與Gao[10]的結論一致。從時間來看，縱觀不同年代和地點分離到的H7N9流感病毒，以發(fā)生疫情的2013年為節(jié)點，H7N9流感病毒的6個內部基因分為兩大分支。2013年之后的毒株不論宿主和地點絕大多數處于同一個大分支，各基因節(jié)段的親緣關系較近，而且GenBank中2013年之后的毒株均分離自中國；而2013年之前的毒株都處于另一大分支。可見，H7N9毒株在2013年發(fā)生了對致病性有重要意義的重組和變異。

參考文獻：

[1] Freidl G S，Binger T，Muller M A， et al. Serological evidence of infl uenza a viruses in frugivorous bats from Africa [J]. PLoS One，2015，10（5）：e0127035.

[2] Tong S，Li Y，Rivailler P，et al. A distinct lineage of infl uenza A virus from bats [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（11）：4269-4274.

[3] Tong S，Zhu X，Li Y，et al. New world bats harbor diverse infl uenza A viruses [J]. PLoS Pathog， 2013，9（10）：e1003657.

[4] Avian infl uenza A（H5N1）--situation （poultry） in Asia as at 2 March 2004： need for a long-term response，comparison with previous outbreaks [J]. Wkly Epidemiol Rec，2004，79（10）：96-99.

[5] Le M Q，Horby P，Fox A，et al. Subclinical avian infl uenza A（H5N1） virus infection in human， Vietnam [J]. Emerg Infect Dis，2013，19（10）：1674-1677.

[6] Butt K M，Smith G J，Chen H，et al. Human infection with an avian H9N2 infl uenza A virus in Hong Kong in 2003 [J]. J Clin Microbiol，2005，43（11）：5760-5767.

[7] Ostrowsky B，Huang A，Terry W，et al. Low pathogenic avian influenza A （H7N2）virus infection in immunocompromised adult，New York，USA，2003 [J]. Emerg Infect Dis，2012，18（7）：1128-1131.

[8] Skowronski D M，Tweed S A，Petric M，et al. Human illness and isolation of low-pathogenicity avian infl uenza virus of the H7N3 subtype in British Columbia，Canada [J]. J Infect Dis，2006，193（6）：899-900；author reply 900-891.

[9] Puzelli S，Rossini G，Facchini M，et al. Human infection with highly pathogenic A（H7N7） avian influenza virus，Italy，2013 [J]. Emerg Infect Dis，2014，20（10）：1745-1749.

[10] Gao R，Cao B，Hu Y，et al. Human infection with a novel avian-origin infl uenza A（H7N9）virus [J]. N Engl J Med，2013，368（20）：1888-1897.

[11] Ogata T，Yamazaki Y Okabe N，et al. Human H5N2 avian infl uenza infection in Japan and the factors associated with high H5N2-neutralizing antibody titer [J]. J Epidemiol，2008，18（4）：160-166.

[12] Arzey G G，Kirkland P D，Arzey K E，et al. Infl uenza virus A （H10N7） in chickens and poultry abattoir workers，Australia [J]. Emerg Infect Dis，2012，18（5）：814-816.

[13] Zhang T，Bi Y，Tian H，et al. Human infection with influenza virus A（H10N8）from live poultry markets，China，2014 [J]. Emerg Infect Dis，2014，20（12）：2076-2079.

[14] Chen R A，Lai H Z，Li L，et al. Genetic variation and phylogenetic analysis of hemagglutinin genes of H9 avian influenza viruses isolated in China during 2010-2012 [J]. Vet Microbiol，2013，165（3-4）：312-318.

[15] Imai M，Watanabe T，Hatta M，et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets [J]. Nature，2012，486（7403）：420-428.

[16] 李建麗，陳恩林，李和平，等. H9N2亞型禽流感病毒NS1基因的進化分析 [J]. 病毒學報， 2008，24（3）：220-226.

[17] Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6：Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 [J]. Mol Biol Evol，2013，30（12）：2725-2729.

[18] Liu D，Shi W，Shi Y，et al. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：phylogenetic，structural，and coalescent analyses [J]. Lancet，2013，381（9881）： 1926-1932.

[19] Xiong C，Zhang Z，Jiang Q，et al. Evolutionary characteristics of A/Hangzhou/1/2013 and source of avian influenza virus H7N9 subtype in China [J]. Clin Infect Dis，2013，57（4）：622-624.

[20] Herfst S，Schrauwen E J，Linster M，et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets [J]. Science，2012，336（6088）：1534-1541.

（責任編輯：朱迪國）

中圖分類號：S855.3

文獻標識碼：B

文章編號：1005-944X（2016）04-0072-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.04.024

通訊作者：陳繼明

Genome Analysis of a H7N9 Infl uenza Virus by High-throughput Sequencing

Wang Kaicheng，Qiu Yuan，Zhuang Qingye，Zhang Xiaochun，Wang Tong，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：To discuss the serveillance，genome analysis and source tracing of H7N9 infl uenza virus genome by highthroughput sequencing，the genome of a H7N9 infl uenza virus was sequenced by Ion Torrent PGM. The characteristics of genome and evolution were analyzed. The results showed that the virus was similar to those viruses causing the H7N9 infl uenza outbreaks of eastern China in 2013. Comprehensive analysis with the 6 internal genes of H7N9 infl uenza virus isolated from different areas and time showed that the H7N9 infl uenza viruses isolated after the outbreaks in 2013 were very different from those viruses isolated before.

Key words：H7N9 infl uenza virus；high-throughput sequencing；genome；molecular evolution