陳琳琳，侯　瑩，丁勝利，施　艷，李洪連

（河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/小麥玉米作物學國家重點實驗室/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002）

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假禾谷鐮孢細胞凋亡基因FpTatD的鑒定與表達分析

陳琳琳，侯瑩，丁勝利，施艷，李洪連

（河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/小麥玉米作物學國家重點實驗室/河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002）

摘要：【目的】鑒定和克隆假禾谷鐮孢（Fusarium pseudograminearum）細胞凋亡相關基因FpTatD，分析FpTatD在假禾谷鐮孢菌絲、分生孢子和侵染不同時期的表達，為探索細胞凋亡在假禾谷鐮孢侵染過程中的功能提供理論依據(jù)。【方法】從GenBank獲得模式物種已知的TatD氨基酸序列，利用BLASTP的方法在鐮孢中鑒定TatD同源蛋白，并構(gòu)建進化樹；分別以假禾谷鐮孢的基因組DNA和cDNA為模板，通過PCR方法克隆假禾谷鐮孢FpTatD的基因序列和開放閱讀框（ORF）序列；利用實時熒光定量PCR方法分析FpTatD在假禾谷鐮孢生長、產(chǎn)孢及侵染不同時期的表達；利用轉(zhuǎn)錄組測序方法分析FpTatD在假禾谷鐮孢與感病小麥和抗病小麥互作中的表達差異。【結(jié)果】鐮刀菌中有4個保守的TatD同源蛋白，與其他物種的TatD蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)TatD在進化上分成兩個大的分支，第一個分支的TatD在所有物種中都非常保守，包括鐮刀菌的TatD1和TatD2，第二個分支的TatD蛋白屬于植物和真菌特有的，包括鐮刀菌的TatD3和TatD4；克隆假禾谷鐮孢的FpTatD1、FpTatD2、FpTatD3、FpTatD4基因長度分別為993、1 331、1 227、1 176 bp，ORF區(qū)長度為993、1 182、1 227、1 176 bp。FpTatD2 5′端包含兩段長度為94和55 bp的非編碼序列，F(xiàn)pTatD1、FpTatD3和FpTatD4均不含非編碼序列。4個FpTatD編碼蛋白質(zhì)的分子量大小分別為36.37、43.13、45.59、44.25 kD。蛋白結(jié)構(gòu)和序列分析顯示FpTatD蛋白均具有明顯的DNase結(jié)構(gòu)域以及大部分保守的氨基酸位點；實時熒光定量PCR分析顯示，F(xiàn)pTatD1和FpTatD2在假禾谷鐮孢中的表達量高，且在侵染初期階段明顯誘導表達，尤其是FpTatD1在侵染36 h和3 d時分別上調(diào)表達8.8倍和7.6倍；而FpTatD3和FpTatD4表達量非常低，且在不同階段的表達量無明顯變化，說明FpTatD1和FpTatD2在假禾谷鐮孢中起主要作用；通過分析假禾谷鐮孢與感病小麥國麥301和抗病小麥周麥24互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，與實時熒光定量PCR結(jié)果一致，F(xiàn)pTatD1和FpTatD2表達量高，并在侵染階段上調(diào)表達，而且相對于假禾谷鐮孢與感病小麥的親和互作中，其與抗病小麥的非親和互作中，F(xiàn)pTatD誘導表達倍數(shù)更高?！窘Y(jié)論】假禾谷鐮孢細胞凋亡相關基因FpTatD可能參與病原菌與寄主的互作過程。

關鍵詞：假禾谷鐮孢；細胞凋亡；TatD核酸酶；基因克?。槐磉_分析

聯(lián)系方式：陳琳琳，E-mail：llchensky@163.com。通信作者李洪連，Tel：0371-63558791；E-mail：honglianli@sina.com

0 引言

【研究意義】假禾谷鐮孢（Fusarium pseudograminearum）于1951年在澳大利亞首次被報道，其引起的小麥莖基腐病每年造成直接經(jīng)濟損失超過10億美元。目前，世界上已有10多個國家先后報道該病害的發(fā)生和危害［1］。2011年，LI等在河南省小麥產(chǎn)區(qū)首次報道假禾谷鐮孢的危害，罹病植物莖基部腐爛、呈蜜褐色病斑，染病地塊的田間發(fā)病率達70％以上，由于常年實施秸稈還田，造成菌源積累，品種抗性差等原因，病害的發(fā)生呈現(xiàn)不斷加重和蔓延趨勢，假禾谷鐮孢已成為中國黃淮麥區(qū)危害小麥生產(chǎn)的重要病原菌［2-3］，而目前對其致病分子機理的研究還非常少。因此，克隆假禾谷鐮孢細胞凋亡相關基因FpTatD，并分析其在生長、產(chǎn)孢和侵染不同時期、侵染不同抗性小麥的表達情況，可為探討細胞凋亡在假禾谷鐮孢致病過程中的作用提供依據(jù)，對于病害防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】核酸酶 TatD是在物種中非常保守的一種細胞質(zhì)蛋白，在細胞凋亡過程中轉(zhuǎn)移到細胞核中降解DNA，從而調(diào)控多種生物的細胞凋亡過程［4-7］。細胞凋亡指生物體中自然發(fā)生的或生理性的細胞死亡，是程序性細胞死亡的一種，在真核生物的生長、發(fā)育以及分化過程中具有非常廣泛和重要的作用，例如維持細胞動態(tài)平衡、清除受損細胞以及對病原體和脅迫的響應等［8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，絲狀真菌發(fā)生的類細胞凋亡過程調(diào)控機體細胞衰老、孢子形成、菌絲融合及致病性等多個生理過程［9-12］。尤其是在病原菌與植物互作過程中，植物通過產(chǎn)生抗毒素等次級代謝產(chǎn)物誘導病原菌細胞凋亡的發(fā)生來阻止病原菌的侵入［13-14］，所以通過調(diào)控病原菌的細胞凋亡可以實現(xiàn)有效的病害控制。在大腸桿菌（Escherichia coli）中，TatD由 Tat操縱子編碼，調(diào)控大腸桿菌 Tat（Twin-Arginine Translocation）蛋白轉(zhuǎn)運途徑［15］。但已有研究表明，與膜蛋白TatA/B/C/E的作用不同，TatD定位在細胞質(zhì)內(nèi)，對折疊蛋白的轉(zhuǎn)運無明顯影響，而具有依賴于Mg2+的內(nèi)切核酸酶活性和3′到5′端外切核酸酶活性，參與多種生物細胞凋亡過程［4，16］。在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）、布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大腸桿菌（Escherichia coli）中分別缺失TatD基因后，細胞對低濃度過氧化氫的耐受性增強，凋亡細胞減少；而過表達 TatD，細胞對過氧化氫的耐受性降低，TUNEL（terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-nick end labeling）陽性細胞增多，說明TatD參與細胞凋亡過程中DNA的降解［4-7］。CHEN等克隆并分析了植物絲狀病原菌大豆疫霉（Phytophthora sojae）的TatD，發(fā)現(xiàn)PsTatD4通過調(diào)控病原菌細胞凋亡的發(fā)生正調(diào)控大豆疫霉無性孢子的產(chǎn)生、負調(diào)控其致病性［17］。【本研究切入點】目前，關于細胞凋亡在假禾谷鐮孢侵染過程中的功能研究尚未見報道，前期筆者通過TUNEL染色法檢測到低濃度過氧化氫能夠誘導假禾谷鐮孢分生孢子細胞凋亡的發(fā)生。【擬解決的關鍵問題】通過鑒定和克隆假禾谷鐮孢細胞凋亡相關基因FpTatD，并利用qRT-PCR及轉(zhuǎn)錄組測序方法分析FpTatD在假禾谷鐮孢菌絲、分生孢子和侵染不同時期、與不同抗性小麥互作的表達，闡釋 FpTatD可能的生物學功能，以期為進一步探究細胞凋亡在假禾谷鐮孢侵染過程中的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2015年4月至2016年2月在河南農(nóng)業(yè)大學小麥病害研究實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 假禾谷鐮孢菌株Wz2-8A，禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）菌株Cz072-7A均由河南農(nóng)業(yè)大學小麥病害研究實驗室分離并保存。

1.1.2 供試植物 對假禾谷鐮孢菌株 Wz2-8A高感小麥品種矮抗58、國麥301以及抗病小麥品種周麥24，由國家小麥工程技術研究中心提供。

1.1.3 酶與試劑 Taq DNA聚合酶、PrimerSTAR HS高保真酶、反轉(zhuǎn)錄PrimeScript? RT reagent Kit（Perfect Real Time）、實時熒光定量 PCR SYBR Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）、T載體pMD?19-T Vector Cloning Kit、DNA Marker購自大連TaKaRa公司；Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自上海生工生物公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 假禾谷鐮孢基因組DNA、RNA及cDNA的制備假禾谷鐮孢菌絲基因組DNA的提取采用CTAB法［18］。假禾谷鐮孢菌絲、分生孢子及侵染不同階段的樣品，參照 Trizol說明書提取總 RNA，最終溶解于 30 μL RNase-free H2O，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，用超微量分光光度計測量 RNA樣品的純度和濃度。取 1 μg RNA 按照 PrimeScript? RT reagent Kit （TaKaRa RR037A）提供的Protocal進行DNA消解和逆轉(zhuǎn)錄反應獲得cDNA。

1.2.2 FpTatD克隆 根據(jù)預測的基因序列設計引物分別從假禾谷鐮孢基因組 DNA和 cDNA中擴增FpTatD的基因序列和 ORF序列。所用引物分別為FpTatD1：F-5′ ATGGCTTCATCTGCAGCAG 3′和R-5′CTACTTCTCCTCGAGTCCA 3′；FpTatD2：F-5′ ATGT CGTCTACTGTTGATC 3′和R-5′ CTAGCGTCGTCCA AGTCCAA 3′；FpTatD3：F-5′ ATGTGCCAATACACC CACA 3′和R-5′ CTACTCTCGTCGTCCAAAG 3′；FpTatD4：F-5′ ATGTGTATGCATGATCATC 3′和R-5′CTAGCCAAATATAAACTCAG 3′。擴增獲得目的條帶，利用DNA膠回收試劑盒純化DNA，連接T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用菌落PCR方法篩選陽性克隆并送上海生工生物公司測序。

1.2.3 TatD蛋白系統(tǒng)進化分析 利用MEGA_4.1軟件構(gòu)建人（Homo sapiens）（NP_114415.1，NP_055575.3 和 NP_001036017.1）、大腸桿菌（YP_026271.1，NP_287234.1和YP_026291.2）［19］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（NP_190807.3，NP_974418.1，NP_187000.1 和 NP_568352.1）、釀酒酵母（NP_009498.1和NP_013989.2）、布氏錐蟲［7］、大豆疫霉［17］和稻瘟菌（Magnaporthe grisea）及4種鐮刀菌TatD蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。利用ClustalX［19］軟件，分析4個FpTatD候選蛋白與大腸桿菌、釀酒酵母、布氏錐蟲、人和擬南芥的TatD蛋白的氨基酸序列。

1.2.4 假禾谷鐮孢菌絲體和分生孢子樣品獲得 檢測假禾谷鐮孢在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC）、綠豆湯培養(yǎng)基（Mung）和康乃馨葉片培養(yǎng)基（Car）中分生孢子的產(chǎn)生，假禾谷鐮孢轉(zhuǎn)接到100 mL液體培養(yǎng)基中，25℃、黑暗條件下150 r/min振蕩培養(yǎng)1、2、4、6、8、10 d后統(tǒng)計產(chǎn)孢量。結(jié)果顯示，假禾谷鐮孢在綠豆湯培養(yǎng)基和康乃馨葉片培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d時即可產(chǎn)生分生孢子，但是孢子量偏低；而在CMC培養(yǎng)基中，從第4 天開始產(chǎn)生大量分生孢子，到第10天孢子量逐漸增多，所以CMC可用作誘導假禾谷鐮孢產(chǎn)孢的培養(yǎng)基。與其親緣關系非常相近的禾谷鐮孢在綠豆湯培養(yǎng)中更適合誘導分生孢子的產(chǎn)生（圖 1-A）。將假禾谷鐮孢分生孢子在 YEPD培養(yǎng)基中、25℃、150 r/min過夜搖培獲得假禾谷鐮孢菌絲體樣品。

1.2.5 假禾谷鐮孢接種 為獲得假禾谷鐮孢侵染小麥不同時期的樣品，選擇感病品種小麥矮抗58，用3％的次氯酸鈉處理3 min后放在1％的瓊脂中保濕催芽3 d后移苗至營養(yǎng)液中繼續(xù)生長至第7天，采用浸根法接種假禾谷鐮孢，孢子濃度為 1.0×106個/mL（圖1-B）。分別在接種18 h、36 h、3 d、6 d、9 d、12 d取小麥根和莖基部0.5 cm提取RNA，用于FpTatD的表達分析（圖1-C）。圖1-B顯示，與對照相比，接種假禾谷鐮孢6 d后的小麥表現(xiàn)出植株矮小、根莖部變褐腐爛等明顯的發(fā)病癥狀。

利用楊云等［20］介紹的溫室盆栽苗期抗性鑒定方法接種，假禾谷鐮孢分別接種感病小麥國麥301和抗病小麥周麥24后5 d（侵染初期）和15 d（侵染中后期）取樣，進行轉(zhuǎn)錄組測序。

A：假禾谷鐮孢和禾谷鐮孢在不同培養(yǎng)基中分生孢子的產(chǎn)生Conidia of F. pseudograminearum and F. graminearum were produced in different culture media；B：小麥育苗及接種Culturation and inoculation of wheat seedlings；C：假禾谷鐮孢菌絲、分生孢子及侵染不同時期的RNA RNA extracts at F. pseudograminearum mycelia， conidia and infection stages圖1　假禾谷鐮孢分生孢子產(chǎn)生、侵染及RNA提取Fig. 1 Conidia production and host infection of F. pseudograminearum， and RNA extraction

1.2.6 實時熒光定量PCR 以TEF1a（FPSE_11980）作為內(nèi)參基因。所用引物為TEF1a：RTF-5′ TCACCA CTGAAGTCAAGTCC 3′和RTR-5′ ACCAGCGACGT TACCACGTC 3′；FpTatD1：RTF-5′ TGATCGAGACT GATGGACC 3′和RTR-5′ CAGGTTCGGCAGCAGCA GT 3′；FpTatD2：RTF-5′ CTTTGTTGGAAGCGCATC AC 3′和RTR-5′ ACTGCTGCTGCCGAACCTG 3′；FpTatD3：RTF-5′GCTGAGGACTTTTCGGATGAG 3′和RTR-5′ ACACTTCAACACTGGCGCTG 3′；FpTatD4：RTF-5′ ACTTTTGTACGACGCCTTG 3′和 RTR-5′CCGTTTGAGTATTTTCTTTC 3′。將不同樣品反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，進行實時熒光定量PCR。反應體系為：SYBR Premix Ex Taq? 10 μL，Primer F（10 μmol·L-1）0.4 μL，Primer R（10 μmol·L-1）0.4 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應程序：95℃ 30 s預變性，40個循環(huán)（95℃ 5 s，60℃ 30 s），引物的特異性可以通過熔解曲線和電泳來判斷。以穩(wěn)定表達的TEF1a為參照進行標準化，將假禾谷鐮孢分生孢子待分析基因表達量定為 1，分析比較相應基因在假禾谷鐮孢與植物互作過程中的相對轉(zhuǎn)錄量。

2 結(jié)果

2.1 FpTatD克隆及序列分析

通過GenBank獲得已知TatD蛋白的氨基酸序列，包括人、布氏錐蟲、擬南芥、大豆疫霉、釀酒酵母和大腸桿菌。通過BLASTP方法對鐮刀菌數(shù)據(jù)庫進行檢索，查找TatD的同源蛋白，然后通過pFAM（E-value ＜1e-5）的方法檢查TatD蛋白已知的DNase結(jié)構(gòu)域，具有明顯的DNase結(jié)構(gòu)域的蛋白列為TatD的候選蛋白，并根據(jù)與酵母 TatD的同源關系進行重新命名。其中假禾谷鐮孢 TatD蛋白分別命名為：FpTatD1：FPSE_08319；FpTatD2：FPSE_06574；FpTatD3：FPSE_07179；FpTatD4：FPSE_05373。

為獲得假禾谷鐮孢FpTatD的基因序列和ORF序列，根據(jù)預測的基因序列設計引物，在以假禾谷鐮孢禾谷鐮孢菌絲體基因組DNA和cDNA為模板的情況下，F(xiàn)pTatD1、FpTatD2、FpTatD3和FpTatD4均獲得目的片段（圖2），并將擴增得到的DNA分別連接載體PUC19并測序。測序結(jié)果顯示FpTatD1、FpTatD2、 FpTatD3、FpTatD4長度分別為993、1 331、1 227、1 176 bp；ORF序列長度分別為993、1 182、1 227、1 176 bp。FpTatD2 5′端第64位和336位分別包含長度為94和55 bp的非編碼序列，F(xiàn)pTatD1、FpTatD3 和FpTatD4均不含非編碼序列，編碼蛋白質(zhì)的分子量大小為36.37、43.13、45.59、44.25 kD。通過pFAM （E-value＜1e-5）方法分析FpTatD蛋白結(jié)構(gòu)域，均具有明顯的DNase結(jié)構(gòu)域。根據(jù)QIU等的報道TatD蛋白含有 21個保守的氨基酸［6］，將假禾谷鐮孢 4個FpTatD蛋白與已知模式物種的TatD蛋白進行氨基酸序列比對，結(jié)果顯示假禾谷鐮孢的 TatD均包含大部分保守氨基酸（附圖1）。

圖2　假禾谷鐮孢FpTatD全長序列及完整開放閱讀框序列的擴增Fig. 2 PCR amplification of FpTatD DNA sequences and entire open reading frame （ORF） sequences in F. pseudograminearum

2.2 TatD蛋白的系統(tǒng)進化分析

根據(jù)人、布氏錐蟲、擬南芥、大豆疫霉、釀酒酵母、稻瘟菌、大腸桿菌和4個鐮刀菌小種的TatD蛋白數(shù)據(jù)構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖3）。進化樹顯示TatD蛋白有兩個明顯的分支，第一個分支包含人、布氏錐蟲、大腸桿菌的全部 TatD蛋白，擬南芥和釀酒酵母的TatD1，大豆疫霉的3個TatD蛋白以及稻瘟菌和4種鐮刀菌的TatD1和TatD2。分析不同物種TatD的相似度可以發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌和稻瘟菌的 TatD蛋白同源性最高，其次分別為釀酒酵母、大豆疫霉、擬南芥、布氏錐蟲、人和大腸桿菌，TatD的進化符合物種進化的方向，說明物種的 TatD蛋白可能來自共同的祖先；第二個分支只包含植物、大豆疫霉、釀酒酵母、稻瘟菌的和鐮刀菌的 TatD蛋白，且同一物種中第一個分支的TatD蛋白與第二個分支的TatD蛋白親緣關系較遠，說明在進化過程中，植物和真菌中進化出一類新的TatD蛋白。不同物種中TatD的數(shù)量存在差異，可能在進化過程中發(fā)生了基因的復制或丟失。

2.3 FpTatD在假禾谷鐮孢菌絲、分生孢子及侵染階段的表達

FpTatD1和FpTatD2表達量較高（FpTatD1在分生孢子階段 Ct值=23.77；FpTatD2在分生孢子階段Ct值=26.32），且在侵染階段上調(diào)表達，尤其是FpTatD1在侵染36 h和3d時分別上調(diào)8.8倍和7.6倍。而FpTatD3和FpTatD4表達量比較低（FpTatD3在分生孢子階段 Ct=30.79；FpTatD4在分生孢子階段Ct=33.68），其在不同階段表達差異較小，說明假禾谷鐮孢的 FpTatD雖然在數(shù)量上發(fā)生擴增，但起主要作用的仍是物種中非常保守的FpTatD1和FpTatD2，且這兩個基因在侵染階段明顯誘導表達，假禾谷鐮孢的TatD可能參與調(diào)控其侵染過程（圖4）。

圖3　TatD蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 The phylogenetic relationship of TatD proteins

2.4 FpTatD在假禾谷鐮孢與不同抗性植物互作中的表達

為了進一步明確 FpTatD在假禾谷鐮孢侵染過程中的作用，分析了假禾谷鐮孢分別與感病品種國麥301和抗病品種周麥24互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，與qRT-PCR結(jié)果類似，F(xiàn)pTatD1和FpTatD2表達量較高，且在侵染階段上調(diào)表達；比較假禾谷鐮孢與不同抗性小麥的互作，其與抗病品種互作的過程中，F(xiàn)pTatD表達量更高（圖5）。在真核生物中TatD正調(diào)控細胞凋亡的發(fā)生，即假禾谷鐮孢在與抗病品種小麥互作中誘發(fā)更強的細胞凋亡［6-7，17］。之前已有研究發(fā)現(xiàn)，植物與病原菌互作過程中，植物通過自身產(chǎn)生的次級代謝物質(zhì)誘發(fā)病原菌細胞凋亡的發(fā)生殺死病原菌以實現(xiàn)有效的抗病［9］。

圖4　FpTatD在假禾谷鐮孢菌絲、分生孢子及侵染不同時期的表達Fig. 4 Transcriptional profiles of FpTatD in F. pseudograminearum conidia， mycelia and infection

圖5　FpTatD在假禾谷鐮孢與感病小麥和抗病小麥互作中的表達Fig. 5 Expression profiles of FpTatD in affinity interaction and non affinity interaction

3 討論

植物與病原菌互作過程中，雙方都通過復雜的網(wǎng)絡試圖去操縱對方的細胞死亡以最大限度的提高自身的生存概率。該過程在互作中最大的特點就是寄主或者病原菌都可能獲益，這取決于誰先獲得平衡［9，21］。眾所周知，植物可以通過局部細胞死亡來抵抗病原菌的侵入，而這種抗性主要取決于寄主的分子信號，同時也受病原菌影響［22-23］。而最近的研究發(fā)現(xiàn)多種病原真菌也在經(jīng)歷著細胞凋亡的發(fā)生，且在病原菌生長、產(chǎn)孢和侵染過程中起至關重要的作用［13，17，24］。但是細胞凋亡過程在鐮刀菌中的作用目前還不清楚。本研究通過分析細胞凋亡相關基因 FpTatD在假禾谷鐮孢生長、產(chǎn)孢及侵染階段的表達，闡述細胞凋亡可能的生物學功能。

TatD是在物種中非常保守的一類核酸酶，參與細胞凋亡最后階段 DNA的降解過程［6］。T. brucei和Leishmania誘導細胞凋亡過程中，TatD從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核中，與內(nèi)切核酸酶 G（EndoG）形成復合體稱為 DNA“降解體”，調(diào)控細胞凋亡過程［25］；在 T. brucei中過表達TatD能增強其細胞凋亡的發(fā)生［7］；在大豆疫霉中，TatD通過調(diào)控其細胞凋亡正調(diào)控無性孢子的產(chǎn)生，負調(diào)控其致病性［17］。本研究中4種鐮刀菌的蛋白組中鑒定到4個TatD蛋白，在進化上分屬兩個分支，TatD1和TatD2在所有物種中都非常保守，而TatD3和TatD4是植物和真菌特有的。

本研究克隆了假禾谷鐮孢 FpTatD的基因序列及ORF序列，其編碼的具有明顯的DNase結(jié)構(gòu)域及大部分TatD保守的氨基酸位點。利用qRT-PCR方法分析假禾谷鐮孢FpTatD在菌絲體、分生孢子和侵染不同時期的表達，F(xiàn)pTatD1和FpTatD2的表達量較高，且在侵染初期階段明顯的誘導表達。進一步分析假禾谷鐮孢與感病小麥和抗病小麥互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在與抗病小麥互作過程中，F(xiàn)pTatD的表達量更高。由此可以推測，假禾谷鐮孢與寄主的互作初期階段，病原菌經(jīng)歷細胞凋亡的誘導發(fā)生，如果發(fā)生水平低，使更多的病原菌存活下來以實現(xiàn)有效的侵染；如果細胞凋亡發(fā)生水平高，將抑制病原菌進一步的侵染和定殖。最近已有研究證實，植物產(chǎn)生的次級代謝物種能夠誘導病原真菌細胞凋亡的發(fā)生，以實現(xiàn)有效的抗病［26-28］。所以也許可以通過合成化學藥劑或者基因工程的方法使植物高表達誘導微生物細胞凋亡的因子來形成植物保護的新策略。

4 結(jié)論

鑒定和克隆了假禾谷鐮孢的FpTatD，其在侵染過程中誘導表達，推測 FpTatD可能參與調(diào)控假禾谷鐮孢與植物的互作過程。

References

［1］ MOOLHUIJZEN P M， MANNERS J M， WILCOX S A， BELLGARD M I， GARDINER D M. Genome sequences of six wheat-infecting Fusarium species isolates. Genome Announcements， 2013， 1（5）：e00670-13.

［2］ LI H L， YUAN H X， FU B， XING X P， SUN B J， TANG W H. First report of Fusarium pseudograminearum causing crown rot of wheat in Henan， China. Plant Disease， 2012， 96（7）： 1065.

［3］ 周海峰， 楊云， 牛亞娟， 袁虹霞， 李洪連. 小麥莖基腐病的發(fā)生動態(tài)與防治技術. 河南農(nóng)業(yè)科學， 2014， 43（5）： 114-117. ZHOU H F， YANG Y， NIU Y J， YUAN H X， LI H L. Occurrence and control methods of crown rot of wheat. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2014， 43（5）： 114-117. （in Chinese）

［4］ WEXLER M， SARGENT F， JACK R L， STANLEY N R， BOGSCH E G， ROBINSON C， BERKS B C， PALMER T. TatD is a cytoplasmic protein with DNase activity. No requirement for TatD family proteins in sec-independent protein export. The Journal of Biological Chemistry， 2000， 275（22）： 16717-16722.

［5］ PARRISH J Z， XUE D. Functional genomic analysis of apoptotic DNA degradation in C. elegans. Molecular Cell， 2003， 11（4）：987-996.

［6］ QIU J， YOON J H， SHEN B. Search for apoptotic nucleases in yeast：role of Tat-D nuclease in apoptotic DNA degradation. The Journal of Biological Chemistry， 2005， 280（15）： 15370-15379.

［7］ GANNAVARAM S， DEBRABANT A. Involvement of TatD nuclease during programmed cell death in the protozoan parasite Trypanosoma brucei. Molecular Microbiology， 2012， 83（5）： 926-935.

［8］ TAYLOR R C， CULLEN S P， MARTIN S J. Apoptosis： controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2008， 9（3）： 231-241.

［9］ SHLEZINGER N， GOLDFINGER N， SHARON A. Apoptotic-like programed cell death in fungi： the benefits in filamentous species. Frontiers in Oncology， 2012， 2： Article 97.

［10］ BRUST D， HAMANN A， OSIEWACZ H D. Deletion of PaAif2 and PaAmid2， two genes encoding mitochondrial AIF-like oxidoreductases of Podospora anserina， leads to increased stress tolerance and lifespan extension. Current Genetics， 2010， 56： 225-235.

［11］ GEORGIOU C D， PATSOUKIS N， PAPAPOSTOLOU I， ZERVOUDAKIS G. Sclerotial metamorphosis in filamentous fungi is induced by oxidative stress. Integrative and Comparative Biology， 2006， 46（6）：691-712.

［12］ HAMANN A， BRUST D， OSIEWACZ H D. Deletion of putative apoptosis factors leads to lifespan extension in the fungal ageing model Podospora anserina. Molecular Microbiology， 2007， 65（4）：948-958.

［13］ SHLEZINGER N， MINZ A， GUR Y， HATAM I， DAGDAS Y F，TALBOT N J， SHARON A. Anti-apoptotic machinery protects the necrotrophic fungus Botrytis cinerea from host-induced apoptotic-like cell death during plant infection. PLoS Pathogen， 2011， 7（8）： e1002185.

［14］ GALLUZZI L， AARONSON S A， ABRAMS J， ALNEMRI E S，ANDREWS D W， BAEHRECKE E H， BAZAN N G， BLAGOSKLONNY M V， BLOMGREN K， BORNER C. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation， 2009， 16（8）： 1093-1107.

［15］ SARGENT F， BOGSCH E G， STANLEY N R， WEXLER M，ROBINSON C， BERKS B C， PALMER T. Overlapping functions of components of a bacterial Sec-independent protein export pathway. The EMBO Journal， 1998， 17（13）： 3640-3650.

［16］ BERKS B C， SARGENT F， PALMER T. The Tat protein export pathway. Molecular Microbiology， 2000， 35（2）： 260-274.

［17］ CHEN L， SHEN D， SUN N， XU J， WANG W， DOU D. Phytophthora sojae TatD nuclease positively regulates sporulation and negatively regulates pathogenesis. Molecular Plant-Microbe Interaction， 2014，27（10）： 1070-1080.

［18］ 陳清清， 孫炳劍， 袁虹霞， 施艷， 李洪連. 小麥根腐病菌索氏平臍蠕孢SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測技術研究. 菌物學報，2014， 33（3）： 690-696. CHEN Q Q， SUN B J， YUAN H X， SHI Y， LI H L. Quantitative detection of Bipolaris sorokiniana in winter wheat based on SYBR Green I real-time PCR. Mycosystema， 2014， 33（3）： 690-696. （in Chinese）

［19］ THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， JEANMOUGIN F，HIGGINS D G. The CLUSTAL_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 4876-4882.

［20］ 楊云， 賀小倫， 胡艷峰， 侯瑩， 牛亞娟， 代君麗， 袁虹霞， 李洪連.黃淮麥區(qū)主推小麥品種對假禾谷鐮刀菌所致莖基腐病的抗性. 麥類作物學報， 2015， 35（3）： 339-345. YANG Y， HE X L， HU Y F， HOU Y， NIU Y J， DAI J L， YUAN H X，LI H L. Resistance of wheat cultivars in Huang-Huai Region of China to crown rot caused by Fusarium pseudograminearum. Journal of Triticeae Crops， 2015， 35（3）： 339-345. （in Chinese）

［21］ NARASIMHAN M L， DAMSZ B， COCA M A， IBEAS J I， YUN D J，PARDO J M， HASEGAWA P M， BRESSAN R A. A plant defense response effector induces microbial apoptosis. Molecular Cell， 2001，8（4）： 921-930.

［22］ DEL POZO O， LAM E. Caspases and programmed cell death in the hypersensitive response of plants to pathogens. Current Biology， 1998，8（24）： R896.

［23］ LAM E. Controlled cell death， plant survival and development. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2004， 5（4）： 305-315.

［24］ BARHOOM S， SHARON A. Bcl-2 proteins link programmed cell death with growth and morphogenetic adaptations in the fungal plant pathogen Colletotrichum gloeosporioides. Fungal Genetics and Biology， 2007， 44（1）： 32-43.

［25］ BOSEDASGUPTA S， DAS B B， SENGUPTA S， GANGULY A， ROY A， DEY S， TRIPATHI G， DINDA B， MAJUMDER H K. The caspaseindependent algorithm of programmed cell death in Leishmania induced by baicalein： the role of LdEndoG， LdFEN-1 and LdTatD as a DNA ‘degradesome'. Cell Death and Differentiation， 2008， 15（10）：1629-1640.

［26］ RAMSDALE M. Programmed cell death in pathogenic fungi. Biochimica et Biophysica Acta， 2008， 1783（7）： 1369-1380.

［27］ SHARON A， FINKELSTEIN A， SHLEZINGER N， HATAM I. Fungal apoptosis： function， genes and gene function. FEMS Microbiology Review， 2009， 33（5）： 833-854.

［28］ SHARON A， SHLEZINGER N. Fungi infecting plants and animals：killers， non-killers， and cell death. PLoS Pathogen， 2013， 9（8）：e1003517.

（責任編輯 岳梅）

Cloning and Expression Analysis of Apoptosis-Related Gene FpTatD in Fusarium pseudograminearum

CHEN Lin-lin， HOU Ying， DING Sheng-li， SHI Yan， LI Hong-lian
（College of Plant Protection， Henan Agricultural University/National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science/ Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops， Zhengzhou 450002）

Abstract：【Objective】The objective of this study is to investigate the potential biological functions of apoptosis-related genes FpTatD in Fusarium pseudograminearum， for this purpose， FpTatD genes were identified and cloned in F. pseudograminearum， and the expression of these genes were examined at mycelia， conidia and infection stages.【Method】 The known TatD proteins were obtained from GenBank， and four TatD candidates in fusariums were identified by BlastP. FpTatD genes and open reading frames（ORF） were amplified from genome DNA and cDNA by PCR， and the transcription levels in mycelia， conidia and infection were examined by qRT-PCR. The expression levels of FpTatD genes in the affinity interaction and non affinity interaction were assayed by RNA-seq.【Result】Four TatD candidates were identified in Fusariums， which divided into two significant branches by the phylogenetic tree. TatD1 and TatD2 belong to an ancient family that is conversed in almost all eukaryotic， while TatD3 and TatD4 seem to come from a unique TatD family that only exists in plants and fungi. Four FpTatD candidates， which identified in F. pseudograminearum were cloned， and the full-length sequences of FpTatD1， FpTatD2， FpTatD3 and FpTatD4 were 993， 1 331，1 227 and 1 176 bp. FpTatD2 contains an intact open reading frame with 94 and 55 bp non-coding sequences in 5′ terminal， while FpTatD1， FpTatD3 and FpTatD4 consist continuous open reading frames. The four clones encode 36.37， 43.13， 45.59 and 44.25 kD proteins. All FpTatD contained the conserved DNase domain and most conserved amino acid residues. qRT-PCR analysis revealed that FpTatD1 and FpTatD2 were highly expressed in F. pseudograminearum， and both were highly up-regulated at early stages of infection. Especially， the expression level of FpTatD1 escalated to 8.8 and 7.6 times in 36 h and 3 d. However， FpTatD3 and FpTatD4 were poorly expressed at all stages. Thus， FpTatD1 and FpTatD2 might play important roles in F. pseudograminearum. RNA-seq analysis was consistent with qRT-PCR results that FpTatD1 and FpTatD2 were highly expressed and up-regulated at early stages of infection. In addition， Compared to the affinity interaction between F. pseudograminearum and GM301， FpTatD genes showed higher expression levels in the non affinity interaction between F. pseudograminearum and ZM24. 【Conclusion】Apoptosis-related gene FpTatD might play an important role in the interaction between F. pseudograminearum and its host.

Key words：Fusarium pseudograminearum； apoptosis； TatD nuclease； gene cloning； expression analysis

收稿日期：2016-03-15；接受日期：2016-04-18

基金項目：國家自然科學基金（30601221）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503112）