寧玉波，王紅艷，喬　康，劉秀梅，王開運(yùn)

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究中心，濟(jì)南 250100）

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靈芝多糖對(duì)番茄抗灰霉病的誘導(dǎo)效應(yīng)

寧玉波1，王紅艷2，喬康1，劉秀梅1，王開運(yùn)1

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究中心，濟(jì)南 250100）

摘要：【目的】誘導(dǎo)抗病劑可以誘導(dǎo)寄主植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，具有持效性和廣譜性的特點(diǎn)。論文以番茄植株為模式植物，番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）為目標(biāo)菌，進(jìn)行溫室盆栽試驗(yàn)，以期明確靈芝多糖誘導(dǎo)劑對(duì)番茄灰霉病的誘導(dǎo)抗性?！痉椒ā坑靡欢ㄙ|(zhì)量濃度的靈芝多糖溶液（50、100、200和400 mg·L-1）噴霧處理盆栽番茄植株第1、2片真葉（正反面），每2 d噴施1次，共誘導(dǎo)3次，最后一次誘導(dǎo)2 d后全株噴霧接種供試菌孢子懸浮液（（1—2）×106個(gè)孢子/mL），對(duì)照組施用等量清水代替靈芝多糖溶液，與各處理平行噴霧接種番茄灰霉菌孢子懸浮液。在接種孢子懸浮液之前用注射器將番茄苗莖基部刺傷，注意傷口不能太大。然后再罩上塑料薄膜保濕24 h，接種孢子懸浮液2 d內(nèi)植株遮陰處理，并用加濕器提高溫室內(nèi)的相對(duì)濕度，相對(duì)濕度控制在不低于90％，溫度控制在（15±5）℃，接種后第 3 天正常光照。通過調(diào)查植株病情指數(shù)，計(jì)算相對(duì)防治效果以評(píng)價(jià)靈芝多糖對(duì)番茄抗灰霉病的誘導(dǎo)效果，并且從防御酶活性、丙二醛（MDA）和葉綠素含量的變化角度評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)抗性的作用機(jī)制。同時(shí)用一定質(zhì)量濃度的靈芝多糖溶液（50、100、200和400 mg·L-1）處理番茄種子并育苗，20 d后測(cè)定番茄幼苗株高、鮮重等多項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)。【結(jié)果】與直接施用等量清水后挑戰(zhàn)接菌的對(duì)照組病情指數(shù)49.25相比，靈芝多糖處理組的番茄植株病情指數(shù)明顯下降，在 32.96—43.85。其中經(jīng)400 mg·L-1靈芝多糖處理的番茄植株病情指數(shù)最低為32.96，相對(duì)防效達(dá)到33.07％。經(jīng)靈芝多糖處理的番茄植株，其體內(nèi)與抗病有關(guān)的防御酶活性也發(fā)生顯著變化，過氧化氫酶（CAT）和多酚氧化酶（PPO）的活性在多糖誘導(dǎo)第3天達(dá)到最高，分別達(dá)到162和98 U·min-1·g-1FW，是對(duì)照組的2.13和1.71倍；過氧化物酶（POD）的活性在誘導(dǎo)后第4天達(dá)到最高值434 U·min-1·g-1FW，是對(duì)照處理組的3.29倍。靈芝多糖能夠系統(tǒng)地誘導(dǎo)番茄體內(nèi) CAT、POD 及 PPO 活性，顯著抑制了感染灰霉菌后番茄植株葉片葉綠素含量的下降。靈芝多糖處理組的MDA含量與對(duì)照組相比有所下降，對(duì)照處理組在取樣期間內(nèi)MDA含量持續(xù)上升，而靈芝多糖處理組在取樣期間內(nèi)MDA含量呈先上升后趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)。各質(zhì)量濃度靈芝多糖對(duì)番茄種子的發(fā)芽率、芽長(zhǎng)和幼苗株高、植株的鮮重均有不同程度的促進(jìn)作用。其中200 mg·L-1靈芝多糖浸泡的番茄種子發(fā)芽率最高，達(dá)87.3％，比對(duì)照組的發(fā)芽率77.3％提高了10.0％；且該處理對(duì)番茄幼苗的株高和地上部分鮮重的促進(jìn)作用也最大，分別較對(duì)照增加了12.9％和33.3％；經(jīng)100 mg·L-1靈芝多糖處理后番茄幼苗的芽長(zhǎng)和地下部分鮮重變化最大，與對(duì)照組相比分別提高了0.16 cm和 0.33 g。【結(jié)論】靈芝多糖能夠誘導(dǎo)番茄植株對(duì)灰霉病產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，同時(shí)對(duì)番茄種子發(fā)芽和番茄植株幼苗生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：靈芝多糖；番茄；灰霉??；誘導(dǎo)抗性；防御酶

聯(lián)系方式：寧玉波，E-mail：nyb408908401@163.com。王紅艷，E-mail：78931220@qq.com。寧玉波和王紅艷為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王開運(yùn)，E-mail：kywang@sdau.edu.cn

0 引言

【研究意義】番茄灰霉?。ㄖ虏【鸀榛移咸焰連otrytis cinerea）是中國(guó)番茄上發(fā)生的重要病害，每年都因該病的發(fā)生造成番茄大量減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)［1-2］。該病發(fā)病時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，現(xiàn)已成為制約番茄生產(chǎn)的主要障礙。目前生產(chǎn)上防治番茄灰霉病以多菌靈、嘧霉胺和腐霉利等化學(xué)藥劑為主，但是化學(xué)防治會(huì)帶來農(nóng)藥使用量不斷增大、花費(fèi)成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題［3］。生物農(nóng)藥因其具有高效、無公害的特點(diǎn)，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的方向，所以倍受關(guān)注，已成為當(dāng)前農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)。植物誘導(dǎo)劑作為生物農(nóng)藥的一種，具有持效性和廣譜性的特點(diǎn)，可以誘導(dǎo)寄主植物獲得系統(tǒng)抗病性，成為解決農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】生物多糖誘導(dǎo)子由于具有綠色無污染和廣譜高效的特點(diǎn)被稱為新型生物農(nóng)藥。靈芝（Ganoderma lucidum）為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，含有多種生物活性成分，其中靈芝多糖是靈芝的關(guān)鍵藥效成分［4-5］，靈芝多糖主要構(gòu)型特征為β-（1→3）-D-線性連接的骨架結(jié)構(gòu)［6-7］，與許多已經(jīng)報(bào)道的真菌多糖結(jié)構(gòu)相一致，同屬于β-（1→3）-葡聚糖類［8］。研究表明海帶多糖、殼寡糖、香菇多糖等多種功能糖能夠通過刺激植株體內(nèi)產(chǎn)生防御反應(yīng)，增強(qiáng)植物對(duì)病害的抵抗能力，從而誘導(dǎo)植株對(duì)植物真菌和病毒病害產(chǎn)生抗性［9-11］，王文霞等［12］將這類具有調(diào)節(jié)植物免疫功能的糖類定義為糖鏈植物疫苗。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于靈芝多糖的研究主要致力于醫(yī)學(xué)方面的功效［13-14］，白丹等［15］采用紙片瓊脂法測(cè)定了100 mg·mL-1靈芝多糖對(duì)供試菌的抑菌強(qiáng)度，結(jié)果表明靈芝多糖對(duì)細(xì)菌的抑菌活性強(qiáng)于真菌，同時(shí)指出靈芝多糖不能抑制灰葡萄孢的生長(zhǎng)。【本研究切入點(diǎn)】關(guān)于靈芝多糖作為誘導(dǎo)子在植物抗病害上的應(yīng)用目前尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以溫室盆栽的番茄植株為研究對(duì)象，用靈芝多糖作為誘導(dǎo)子，探討靈芝多糖對(duì)番茄抗灰霉病的誘導(dǎo)效果及其誘導(dǎo)抗性的作用機(jī)制，為靈芝多糖作為誘導(dǎo)劑的開發(fā)和在植物病害防治上的有效應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2014—2015年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 供試材料

番茄（Solanum lycopersicum）品種為東風(fēng)4號(hào)，購(gòu)自山東省泰安市房村鎮(zhèn)豐源種苗有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，分裝，滅菌）。PD培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，分裝，滅菌）。

供試菌種：從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院日光溫室內(nèi)的盆栽番茄植株上采集發(fā)病比較典型的番茄灰霉病葉，用無菌水沖洗葉片，剪取葉片發(fā)病部位浸于80％無水乙醇中1 min消毒處理，將消毒后的葉片貼放于無菌PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，7 d后挑取菌落邊緣的菌絲接于新的平板上繼續(xù)培養(yǎng)。

孢子懸浮液的配置：打取直徑7 mm上述供試菌餅，置于盛有100 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶中，放于搖床中振蕩培養(yǎng)10 d后，病原菌培養(yǎng)物用無菌水兩層紗布過濾，將濾液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，去沉淀加適量蒸餾水稀釋，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)濾液孢子數(shù)，最終配成孢子懸浮液濃度為（1—2）×106個(gè)孢子/mL，用于接種。

1.2.1 靈芝多糖的制備 以靈芝子實(shí)體粉末為原料，以水為溶劑，采用水提醇沉法提取靈芝多糖。稱取粉碎后干燥靈芝子實(shí)體粉末100 g，加入15倍體積蒸餾水加熱回流2 h，殘?jiān)诱麴s水回流提取2次，合并上清液，過濾，真空濃縮至200 mL。采用Sevage法除去蛋白，濃縮液置于分液漏斗中，每100 mL濃縮液加20 mL氯仿正丁醇液（v∶v= 4∶1 ），振蕩30 min后靜止放置12 h，去除水相與溶劑相中間的白色膠狀物，溶液離心15 min（12 000 r/min），去除雜質(zhì)。向溶液中加入4倍體積無水乙醇，靜置24 h后收集白色絮狀物，用丙酮洗滌2次，所得白色絮狀物在冷凍干燥箱中冷凍干燥即得粉末狀粗多糖。采用苯酚-硫酸法測(cè)定靈芝多糖的含量。

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確量取0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL置于10 mL試管中，加蒸餾水定容至1 mL，向每個(gè)試管中加入1 mL 現(xiàn)配的濃度為6％苯酚溶液，迅速加入5 mL濃硫酸溶液，搖勻，將所得溶液沸水浴顯色15 min，冷水冷卻至室溫，于490 nm處檢測(cè)吸光度值（OD）。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

（2）樣品含量測(cè)定 稱取靈芝多糖樣品10 mg，定容至100 mL容量瓶中，吸取上述溶液1.0 mL，按上述步驟操作，在490 nm處測(cè)吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.2 靈芝多糖對(duì)番茄抗灰霉病誘導(dǎo)作用的測(cè)定 番茄幼苗4葉期時(shí)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的番茄幼苗，將一系列質(zhì)量濃度（50、100、200和400 mg·L-1）的靈芝多糖溶液（含0.03％的Tween-80）用噴霧法處理番茄第1、2片真葉（正反面），罩上塑料薄膜，每2 d噴施一次，共噴施3次。最后一次噴施2 d后全株噴霧接種供試菌孢子懸浮液（（1—2）×106個(gè)孢子/mL），在接種孢子懸浮液之前用注射器將番茄苗莖基部刺傷，注意傷口不能太大。然后再罩上塑料薄膜保濕24 h，接種后2 d內(nèi)植株遮陰處理，并用加濕器提高溫室內(nèi)的相對(duì)濕度，相對(duì)濕度控制在不低于90％，溫度為（10±5）℃，第3天正常光照。接種后15 d調(diào)查番茄植株發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效。對(duì)照組以蒸餾水代替靈芝多糖處理植株后接種孢子懸浮液，各個(gè)處理組均設(shè)3組重復(fù)，每組重復(fù)10株植株。番茄灰霉病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照陸家云等［16］的標(biāo)準(zhǔn)。0級(jí)：無病斑，葉片無癥狀，植株健康；1級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的10％以下，葉脈間黃化；2級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的10％—50％，葉脈變黃且萎蔫；3級(jí)：病斑面積占總?cè)~片的50％以上，整個(gè)植株萎蔫；4級(jí)：植株死亡。

1.2.3 靈芝多糖浸種下番茄種子和幼苗生長(zhǎng)活性的測(cè)定 選取籽粒飽滿一致的番茄種子分別在50、100、200和400 mg·L-1靈芝多糖溶液中浸泡8 h后置于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿（內(nèi)徑9.0 cm）中，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)，加5 mL蒸餾水，對(duì)照組用等量蒸餾水處理，定時(shí)補(bǔ)充定量的蒸餾水保持濾紙濕潤(rùn)，在（25±1）℃恒溫箱內(nèi)催芽7 d后記錄不同處理組番茄種子的發(fā)芽率和芽長(zhǎng)。將不同處理組的番茄種子播種到育苗盤中育苗，當(dāng)2片子葉完全展開后挑選生長(zhǎng)一致的番茄幼苗移栽到塑料花盆中（育苗基質(zhì)∶土壤=1∶1）。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株番茄幼苗。番茄幼苗生長(zhǎng)20 d后記錄番茄幼苗的株高和鮮重等生長(zhǎng)參數(shù)。

1.2.4 靈芝多糖對(duì)番茄相關(guān)防御酶活性影響的測(cè)定參照1.2.2的方法，選取誘導(dǎo)效果最佳濃度的靈芝多糖處理番茄植株以及2 d后接種供試菌種孢子懸浮液。對(duì)靈芝多糖誘導(dǎo)番茄抗灰霉病的生理機(jī)制進(jìn)行研究，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下4個(gè)處理：清水（CK）；不經(jīng)靈芝多糖處理接種番茄灰霉菌（CK-接種）；經(jīng)靈芝多糖處理但不接種番茄灰霉菌（GLP）；經(jīng)靈芝多糖處理并接種番茄灰霉菌（GLP-接種）。粗酶液的制備參照劉太國(guó)等［17］略有改動(dòng)。于植株接種番茄灰霉菌后1—7 d，分別取番茄植株第3—4片展開葉（未經(jīng)誘導(dǎo)處理）用于測(cè)定過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）的活性。

（1）CAT活性的測(cè)定 參照鄒琦［18］的方法。測(cè)定240 nm下的吸光度，以1 min內(nèi)OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位（U·min-1·g-1FW）。

（2）PPO活性的測(cè)定 參考鄰苯二酚法［19］。PPO以每克葉片鮮質(zhì)量每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位（U·min-1·g-1FW）。

（3）POD活性的測(cè)定 參考愈創(chuàng)木酚法［20］。POD以每克葉片鮮質(zhì)量每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活單位（U·min-1·g-1FW）。

1.2.5 靈芝多糖對(duì)番茄丙二醛含量影響的測(cè)定 參照李合生［21］的方法采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛的含量（μmol·g-1）。

1.2.6 靈芝多糖對(duì)番茄葉片葉綠素含量影響的測(cè)定葉綠素含量測(cè)定參考彭運(yùn)生等［22］的方法，接種番茄灰霉菌后第15天取樣測(cè)定葉綠素含量，包括葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量。具體過程為取不同處理番茄植株同一部位葉片0.1 g（未經(jīng)多糖誘導(dǎo)），液氮研磨后置于盛有9 mL丙酮和無水乙醇配置的混合浸提液（v∶v=2∶1）中，置于暗處觀察葉片完全變白為準(zhǔn)，以混合浸提液作為空白調(diào)零，測(cè)定663、645 nm處吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2003和 SPSS16.0軟件 One-Way ANOVA中LSD法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果

2.1 靈芝多糖含量的測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示，線性回歸方程為y=0.0088x+0.2929，線性方程相關(guān)系數(shù)為0.9933，線性關(guān)系良好。根據(jù)待測(cè)靈芝多糖溶液的吸光度0.52，計(jì)算靈芝多糖的有效含量為25.8％。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of glucose

2.2 靈芝多糖對(duì)番茄抗灰霉病的誘導(dǎo)作用

在50—400 mg·L-1靈芝多糖處理后，番茄感染灰霉病的程度有所降低，病情指數(shù)均較對(duì)照有所下降，但在較低濃度靈芝多糖范圍內(nèi)病情指數(shù)與對(duì)照組間差異不顯著。其中400 mg·L-1靈芝多糖病情指數(shù)最小為32.96，相對(duì)防效達(dá)到33.07％，誘導(dǎo)效果最佳（表1）。

2.3 靈芝多糖浸種對(duì)番茄種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

50—400 mg·L-1靈芝多糖對(duì)番茄種子發(fā)芽率、芽長(zhǎng)、幼苗株高、植株質(zhì)量均表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。其中 200 mg·L-1靈芝多糖浸泡的番茄種子發(fā)芽率最高，達(dá)87.3％，比對(duì)照的發(fā)芽率77.3％提高了10.0％；且該處理對(duì)番茄幼苗的株高和地上部分鮮重的促進(jìn)作用也最大，分別較對(duì)照增加了12.9％和33.3％；經(jīng)100 mg·L-1靈芝多糖處理后番茄幼苗的芽長(zhǎng)和地下部分鮮重變化最大，分別比對(duì)照組提高了0.16 cm和0.33 g。但是經(jīng)不同濃度多糖處理后的番茄種子芽長(zhǎng)和地下部分鮮重之間差異性不顯著（表2）。

2.4 靈芝多糖對(duì)番茄抗灰霉病誘導(dǎo)機(jī)制

2.4.1 靈芝多糖處理對(duì)番茄幼苗葉片保護(hù)酶活性的影響 由圖2-A可知，在整個(gè)取樣過程中，CK組的CAT活性變化平穩(wěn)，變化范圍在 60—85 U·min-1·g-1FW；在取樣第2天，GLP處理組CAT活性達(dá)到最大（122 U·min-1·g-1FW），是CK組的1.69倍；在取樣第3天，GLP-接種處理組CAT活性達(dá)到峰值（162 U·min-1·g-1FW），是CK組的2.13倍；之后緩慢下降，在取樣的7 d內(nèi)，GLP和GLP接種處理組CAT活性均明顯高于CK組。表明GLP具有誘導(dǎo)CAT活性升高的作用，GLP-接種處理的誘導(dǎo)效果明顯高于GLP單獨(dú)處理。CK接種處理組CAT活性在前4 d比CK組增加，且在接種第2天達(dá)到峰值，是CK組的1.29倍，之后逐漸降低?？梢娊臃N病原菌可以短時(shí)間內(nèi)刺激番茄植株體內(nèi)CAT活性的表達(dá)，但是持續(xù)時(shí)間較短。

表1　不同濃度靈芝多糖的誘導(dǎo)效果Table 1 The induced resistance with different concentrations of GLP

由圖2-B可知，在整個(gè)取樣過程中，CK組的POD活性呈緩慢上升的趨勢(shì)；在取樣第4天，GLP-接種處理組POD活達(dá)到最大（434 U·min-1·g-1FW），是CK組的3.29倍。GLP處理組在整個(gè)處理過程中呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，但明顯低于GLP-接種處理組的POD活性，兩處理組在處理的7 d內(nèi)，POD活性升高值比CK組高得多。表明GLP具有誘導(dǎo)POD活性升高的作用，GLP-接種處理的誘導(dǎo)效果明顯高于 GLP單獨(dú)處理，GLP-接種處理的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為接種后第 4天；CK接種處理組POD活性變化顯著，在取樣的7 d，POD活性顯著高于CK處理組，可見接種病原菌可以有效刺激番茄植株體內(nèi)POD活性的表達(dá)。

由圖2-C可知，在整個(gè)取樣過程中，CK組的PPO活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，PPO活性變化范圍在40 —60 U·min-1·g-1FW，保持在一個(gè)平穩(wěn)的水平；在取樣第 3天，GLP-接種處理組 PPO活性達(dá)到最大（98 U·min-1·g-1FW），是CK組的1. 71倍，之后略有下降，但基本上維持在恒定水平，第7 天時(shí)PPO活性為90 U·min-1·g-1FW。GLP處理組在處理第3天時(shí)，PPO活性達(dá)到最大（80 U·min-1·g-1FW），是CK組的1.37倍，之后PPO活性迅速下降，明顯低于GLP-接種處理組的PPO活性，兩處理組在處理的7 d內(nèi)，PPO活性均明顯高于CK組。表明GLP具有誘導(dǎo)PPO活性升高的作用，GLP-接種處理的誘導(dǎo)效果明顯高于GLP單獨(dú)處理，GLP-接種處理的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為接種后第3天，經(jīng)GLP-接種處理的番茄植株P(guān)PO活性的持效期明顯比GLP單獨(dú)處理的持效期長(zhǎng)，在第7天取樣時(shí)，PPO仍保持一定的活性；CK接種處理組PPO活性在處理3 d內(nèi)變化顯著，PPO活性較CK組迅速上升，于第3天達(dá)到峰值76 U·min-1·g-1FW，明顯高于CK組PPO活性。之后PPO活性迅速下降，與CK組PPO活性基本一致?？梢娊臃N病原菌對(duì)番茄植株體內(nèi)PPO的活性有明顯的刺激作用，但是作用時(shí)間短，持續(xù)期不長(zhǎng)。

2.4.2 靈芝多糖處理對(duì)番茄幼苗葉片丙二醛含量的影響 由圖2-D可知，接種處理組中丙二醛的含量較未接種處理組變化顯著，CK-接種處理組在取樣期間內(nèi)MDA含量持續(xù)上升，而GLP-接種處理組在取樣期間內(nèi)MDA含量呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)變化，且CK-接種處理組在取樣期間內(nèi)MDA含量顯著高于GLP-接種處理組的MDA含量。而未接種處理組CK、GLP處理組MDA含量變化平穩(wěn)，在取樣前5 d內(nèi)，GLP處理組MDA含量較CK處理組有明顯下降的趨勢(shì)。

圖2　靈芝多糖處理對(duì)番茄葉片保護(hù)酶活性及丙二醛含量的影響Fig. 2 Dynamic curve of protective enzyme activities and content of MDA after GLP treatment in tomato

2.4.3 靈芝多糖處理對(duì)番茄幼苗葉片葉綠素含量的影響 接種番茄灰霉菌處理組的葉片葉綠素含量明顯低于未接種處理組，其中只接種灰霉菌（接種處理組）的葉綠素含量又明顯低于經(jīng) GLP處理后又接種灰霉菌的植株（GLP-接種）；未經(jīng)GLP處理而接種番茄灰霉菌的植株葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量比經(jīng) GLP處理后接種的植株分別下降 26.5％、33.3％和45.6％，而噴施靈芝多糖后接種的番茄植株葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量比健康植株（CK組）處理組分別下降19％、6.6％和1.6％（圖3）。

3 討論

迄今為止，國(guó)內(nèi)外已有許多文獻(xiàn)報(bào)道食藥菌多糖具有激活植物機(jī)體免疫、誘導(dǎo)植株自身產(chǎn)生抗病性，使植株獲得系統(tǒng)抗病性（systemic acquired resistance，SAR）［23-27］。前期研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖與香菇多糖、殼寡糖等激發(fā)子具有同一基本骨架β-1，3 glucan結(jié)構(gòu)，而β-1，3 glucan在對(duì)煙草花葉病、葡萄灰霉病的防治方面已表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)抗病活性。本文通過葉面噴霧法噴施不同濃度的靈芝多糖，均可有效誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病的抗病性，400 mg·L-1的靈芝多糖誘導(dǎo)效果最佳，相對(duì)防效為33.07％，產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性反應(yīng)。番茄灰霉病是保護(hù)地番茄生產(chǎn)的毀滅性病害，在田間生產(chǎn)上已造成大面積的減產(chǎn)，嚴(yán)重威脅著番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究通過噴施靈芝多糖能夠?qū)Ψ芽够颐共∑鸬揭欢ǖ恼T導(dǎo)效應(yīng)，提高了番茄葉片保護(hù)酶的活力，而番茄葉片保護(hù)酶活力的水平在一定程度上反映了植株的抗病能力。CAT和POD具有清除自由基，延緩植物衰老的功能［28-29］。PPO是植保素、木質(zhì)素、酚類和醌類等物質(zhì)的合成過程的關(guān)鍵酶，促使細(xì)胞壁木質(zhì)化從而減少病原菌對(duì)植物的損傷［30］，已有研究證明PPO活性的變化是植物抗病性的重要生理指標(biāo)［31］。本試驗(yàn)中經(jīng)靈芝多糖誘導(dǎo)后接種番茄灰霉病病原菌的植株體內(nèi)CAT、POD和PPO活性均較對(duì)照組有所提高，相應(yīng)增強(qiáng)了番茄植株防御灰霉病侵染的能力，在靈芝多糖誘導(dǎo)7 d內(nèi)，番茄植株體內(nèi)CAT、POD和PPO保持較高的活性，說明靈芝多糖的誘導(dǎo)作用不僅能夠阻止番茄灰霉病菌對(duì)植株的侵染，同時(shí)還具有一定的持效性，這在一定程度上降低了灰霉病的發(fā)展，以便采取其他綜合防治策略來控制病害。MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，作為膜脂過氧化的一個(gè)重要指標(biāo)，反映細(xì)胞膜損傷程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱［32］。本試驗(yàn)中經(jīng)靈芝多糖誘導(dǎo)后接種番茄灰霉病病原菌的植株MDA含量明顯低于CK接種處理組的含量，表明經(jīng)靈芝多糖處理番茄植株接種病原菌后對(duì)MDA含量有一定的抑制作用，從而可減少膜質(zhì)過氧化作用對(duì)細(xì)胞的傷害，提高植株對(duì)病害的抗逆能力，這一結(jié)果也與其他誘抗劑作用植株中MDA含量變化相一致［33-34］；由于沒有病原菌的作用，所以CK組與GLP處理組MDA含量變化不顯著。本研究中，經(jīng)靈芝多糖處理后，番茄葉片保護(hù)酶的活力有所提高并在一定程度上抑制了丙二醛含量的積累，而保護(hù)酶活性的增強(qiáng)和丙二醛含量的抑制均可減輕病原菌對(duì)番茄植株的損傷，從而起到誘導(dǎo)植株抗病的作用。植株葉綠素含量的高低直接反映著光合作用的強(qiáng)弱，含量越高，光合作用越強(qiáng)。光合作用是植株的重要代謝過程，是衡量植株抗病性強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)［35］。本試驗(yàn)中經(jīng)過靈芝多糖處理的番茄植株接種灰霉菌（GLP-接種組）15 d后，植株葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量與對(duì)照接種組（CK-接種組）相比均有所上升，其原因可能是經(jīng)靈芝多糖誘導(dǎo)后刺激了番茄體內(nèi)木質(zhì)素和植保素的合成，而木質(zhì)素和植保素均可對(duì)病原菌的浸染起到保護(hù)作用，從而減小了真菌對(duì)植株組織葉綠體的破壞。醫(yī)用靈芝多糖是從靈芝子實(shí)體中提取得到，因靈芝子實(shí)體既是醫(yī)藥原料［36-37］，也是具有保健作用的食材［38］，所以靈芝多糖作為抗病誘導(dǎo)劑及生物農(nóng)藥的開發(fā)，勢(shì)必與前兩者存在原料上的競(jìng)爭(zhēng)性。為此，本研究還從栽培靈芝的廢棄物菌糠中提取靈芝多糖進(jìn)行了試驗(yàn)，成功從菌糠中提取制備了靈芝多糖，其提取率可達(dá) 0.36％，從靈芝子實(shí)體和菌糠中提取的靈芝多糖，在相同濃度下其誘導(dǎo)活性基本一致。提取靈芝多糖后的菌糠能用于有機(jī)肥生產(chǎn)，可形成靈芝栽培、多糖提取和菌糠充分利用的高效循環(huán)產(chǎn)業(yè)體系。不僅實(shí)現(xiàn)了資源的充分利用，還大大降低了制取靈芝多糖的成本，同時(shí)也為靈芝培養(yǎng)基廢棄物的綜合利用，變“廢”為“寶”開辟一條新的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

柱上不同小寫字母表示各處理經(jīng)LSD多重比較在P=0.05水平差異顯著Means followed by different lowercases in each column indicated significant differences at P=0.05 level by LSD's multiple comparison圖3　靈芝多糖處理對(duì)番茄葉片葉綠素含量的影響Fig. 3 Effects of GLP treatment in tomato leaves on the chlorophyll content

由于番茄灰霉病發(fā)病迅速，從發(fā)病到蔓延一般只需7—12 d。誘導(dǎo)劑的效果不易發(fā)揮，靈芝多糖作為抗病誘導(dǎo)劑單獨(dú)使用防治番茄灰霉病效果不十分顯著，實(shí)踐證明香菇多糖誘導(dǎo)劑與殺菌劑氟醚菌酰胺混用，在黃瓜霜霉病的預(yù)防中比單獨(dú)使用香菇多糖誘導(dǎo)劑或殺菌劑氟醚菌酰胺效果好，在達(dá)到相同防治效果的前提下，殺菌劑氟醚菌酰胺的用藥量減少25％，不僅可以有效減少殺菌劑的使用量，還可以提高對(duì)有害生物的防治效果［39］。表明多糖類誘導(dǎo)劑與殺菌劑混用具有提高防效、減少殺菌劑用藥量的顯著效果。符合當(dāng)代農(nóng)業(yè)減少農(nóng)藥用量，降低產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的發(fā)展戰(zhàn)略，將成為將來病害防治的主要方向。

4 結(jié)論

對(duì)靈芝多糖的誘導(dǎo)活性試驗(yàn)證明一定質(zhì)量濃度的靈芝多糖能夠誘導(dǎo)番茄抗灰霉病，顯著提高了番茄植株體內(nèi)保護(hù)酶的活性；經(jīng)靈芝多糖誘導(dǎo)的番茄植株體內(nèi)葉綠素和丙二醛含量與對(duì)照組相比也有顯著的變化；適量濃度的靈芝多糖對(duì)番茄種子發(fā)芽率和番茄幼苗生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Induced Resistance by Polysaccharides Isolated from Ganoderma lucidum in Tomato Against Gray Mold

NING Yu-bo1， WANG Hong-yan2， QIAO Kang1， LIU Xiu-mei1， WANG Kai-yun1
（1College of Plant Protection， Shandong Agriculture University， Tai'an 271018， Shandong；2Cotton Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100）

Abstract：【Objective】The systemic long-lasting and broad-spectrum resistance was induced with natural or synthetic compounds. The objective of this study is to investigate the induced resistant effect of polysaccharide extracted from the fruiting body of Ganoderma lucidum （GLP） in tomato against gray mold.【Method】The 1-2 true leaf of tomato plants were sprayed with polysaccharides （50， 100， 200 and 400 mg·L-1）for 3 times once every 2 days and inoculated spore suspension of Botrytis cinerea after 2 days later of the last time GLP treatment （（1-2）×106spores/mL）， meanwhile， the plants treated with the same volume of distilled water used as control instead of GLP solution and inoculated spore suspension of B. cinerea. A syringe stabbed the stem of tomato plant before inoculated spore suspension. Covering plastic film in order to moisturize 24 h and keeping humidity the 2 days of inoculating spore suspension of B. cinerea， the greenhouse relative humidity was not less than 90％ and temperature was （15±5） ℃，normal light was recovered 3 days later. The disease index and disease reduction against gray mold in tomato plants was investigated. Simultaneously， the tomato seedlings were soaked in the concentration （50， 100， 200 and 400 mg·L-1） of polysaccharides and then cultivated in pots. The germination rate， root length and plant height， shoot weight， fresh weight of tomato seedlings were measured 20 days after treatment with polysaccharides. 【Result】Compared with the clear water control's disease index 49.25， the GLP treatment groups' disease index were between with 32.96-43.85， significantly reduced， it was found that the lowest disease index 32.96 at the concentration of 400 mg·L-1GLP treatment and the disease reduction was 33.07％. The activity of protective enzyme in leaves showed different dynamic changes after GLP treatment， catalase （CAT） and polyphenoloxidase （PPO） activities remarkably increased， and the activities reached the highest peak after 3 days of induction. The highest CAT （162 U·min-1·g-1FW） and PPO （98 U·min-1·g-1FW） were 2.13 and 1.71 times compared with the control group， respectively. Peroxidase （POD） activity reached the highest peak after 4 days of induction then decreased gradually， significantly higher than the control. The highest POD （434 U·min-1·g-1FW） was 3.29 times compared with the control groups. MDA content after application of GLP showed a down trend compared to that of control. When the seed was treated with polysaccharides， the germination rate， root length and plant height， shoot weight， root weight of tomato seedlings all increased to a certain degree. The treatment at the concentration of 200 mg·L-1GLP showed the highest germination rate 87.3％， 10.0％ higher than the control group germination rate 77.3％. Simultaneously， the treatment at the concentration of 200 mg·L-1GLP showed the highest promotion in the tomato plant height and shoot weight，enhanced 12.9％ and 33.3％ respectively than the control. The tomato seed germinal length and root weight enhanced 0.16 cm and 0.33 g respectively than the control at the concentration of 100 mg·L-1GLP.【Conclusion】GLP at appropriate concentration had the ability to induce systematic resistance against gray mold. In addition， GLP promoted the growth of tomato seedlings.

Key words：Ganoderma lucidum polysaccharides； tomato； gray mold； induced resistance； defensive enzymes

收稿日期：2016-01-25；接受日期：2016-03-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2014BAD05B03）、山東省自然科學(xué)基金青年基金（ZR2015CQ024）