張　江 譯自Asian Australas. J. Anim. Sci.，Vol.28（2015），№9：1362～1370

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日糧蛋白水平對(duì)豬糞惡臭化合物及細(xì)菌生態(tài)的影響

張江 譯自Asian Australas. J. Anim. Sci.，Vol.28（2015），№9：1362～1370

集約化畜牧生產(chǎn)體系具有確切的經(jīng)濟(jì)效益，但也產(chǎn)生諸多負(fù)面影響，尤其是惡臭和畜禽廢棄物處理。臭味產(chǎn)生受到豬舍類型和糞便處理系統(tǒng)的影響，大多數(shù)豬舍都為開(kāi)放式通風(fēng)（占總豬舍的76 %）和漏縫地板系統(tǒng)（占全部糞便處理系統(tǒng)的52 %），豬糞和污染地面不斷釋放出惡臭氣味。

惡臭氣味主要是由豬胃腸道和糞便飼料殘?jiān)?nèi)源生成物及死亡腸道細(xì)菌通過(guò)厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)生。有230多種成分會(huì)產(chǎn)生惡臭，主要分為4類：1）含硫化合物，2）酚和吲哚化合物，3）揮發(fā)性脂肪酸，4）氨和胺類，可通過(guò)測(cè)定惡臭化合物的濃度和氣味活性值（OAV）得出的臭氣強(qiáng)度進(jìn)行歸類。碳水化合物分解代謝為短鏈脂肪酸（SCFA）、CO2、H2和CH4，蛋白質(zhì)則可代謝為短鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸（BCFA）、酚、吲哚、硫、氨和胺，因此惡臭化合物主要是通過(guò)蛋白質(zhì)降解過(guò)程產(chǎn)生，大量日糧蛋白進(jìn)入到胃腸道中（大約每天12 g～18 g），腸上皮細(xì)胞、酶和死細(xì)菌等內(nèi)源性蛋白源也會(huì)導(dǎo)致惡臭化合物形成。攝入的氮大約有70 %排出體外，為細(xì)菌發(fā)酵提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，并導(dǎo)致惡臭化合物生成。

豬的胃腸道和糞便中存在數(shù)千種細(xì)菌。其中擬桿菌、梭菌、丙酸菌、梭桿菌、鏈球菌和乳桿菌在蛋白質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，這些細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)日糧蛋白的精確影響機(jī)制仍不清楚。焦磷酸測(cè)序等新型分子技術(shù)對(duì)確定豬糞微生物菌群特征非常有效。本研究應(yīng)用這些技術(shù)分析不同日糧粗蛋白水平對(duì)豬糞惡臭化合物濃度的影響，以及豬糞中惡臭化合物與菌群之間的相互關(guān)系。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)、動(dòng)物與日糧

動(dòng)物試驗(yàn)方案得到了國(guó)家動(dòng)物科學(xué)研究所動(dòng)物關(guān)愛(ài)和使用委員會(huì)的審核和批準(zhǔn)。試驗(yàn)對(duì)生長(zhǎng)豬飼喂不同水平粗蛋白（20 %、17.5 %、15 %，飼料營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1）后糞便惡臭化合物組成和菌群情況進(jìn)行研究。48頭公豬【（長(zhǎng)×大）×杜洛克】隨機(jī)分為3個(gè)粗蛋白水平組，每個(gè)處理4窩，每窩4頭，平均初重（BW）為45 kg。每窩均在豬舍漏縫地板下設(shè)置獨(dú)立的儲(chǔ)糞坑。通過(guò)室內(nèi)溫度和濕度自動(dòng)控制器調(diào)節(jié)豬舍通風(fēng)速度，豬舍平均溫度和相對(duì)濕度分別保持在20 ℃～25 ℃和60 %。飼料喂食量為體重的5 %，每天飼喂2次。試驗(yàn)前有10 d的適應(yīng)期，開(kāi)始集糞前清洗儲(chǔ)糞坑。

1.2糞便收集與惡臭化合物分析

糞便收集：本研究所有處理組的樣品采集均在相同條件下進(jìn)行。試驗(yàn)為期1個(gè)月，每周分別采集各窩糞便樣品，并儲(chǔ)存于冰箱中（-20 ℃）。氣相色譜法（GC）測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸、酚和吲哚等惡臭化合物含量。

揮發(fā)性脂肪酸：5 mL糞便樣品與1 mL 25 %的偏磷酸溶液及0.05 mL飽和氯化汞溶液混合，置于15 mL試管中?；旌先芤涸? 000 rpm、20 ℃下離心20 min，取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL試管。然后將上清液在12 000 rpm下離心10 min，并通過(guò)0.2 μm的過(guò)濾器。濾液轉(zhuǎn)移至2.0 mL GC小瓶，氣相色譜法（6890N，HP-INNOWax柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器）分析揮發(fā)性氣體濃度。溫度設(shè)定：80 ℃ 2 min，20 ℃/ min的速度升溫至120 ℃，10 ℃/min升溫至205 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口和檢測(cè)口的溫度保持在250 ℃。進(jìn)樣量為0.2 μL，分流比10∶1。

酚和吲哚：糞便樣品在20 ℃、4 000 rpm下離心20 min。取4 mL上清液，與4 mL氯仿和60 μL 4 M氫氧化鈉溶液混合，置于20 mL玻璃小瓶中?；旌先芤涸?0 ℃、4 000 rpm下離心20 min，將氯仿層移至2.0 mL GC小瓶中，氣相色譜法（6890N，DB～1柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器）分析酚類和吲哚類化合物。柱溫溫度設(shè)定：40 ℃保持5 min，20 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持2 min。進(jìn)樣口和檢測(cè)口的溫度保持在250 ℃。進(jìn)樣量為2.0 μL，分流比5∶1。

1.3菌群分析

用于bar-coded焦磷酸測(cè)序的PCR擴(kuò)增：按制造商說(shuō)明使用快速DNA提取試劑盒從糞便樣品中提取總基因組DNA。使用Power-Clean DNA抑制因子去除試劑盒除去腐殖酸等干擾成分。使用引物組擴(kuò)增含V1～V3可變區(qū)、大約500 bp～700 bp的細(xì)菌16S rRNA基因。PCR擴(kuò)增條件是開(kāi)始95 ℃ 5 min預(yù)變性，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s及72 ℃ 30 s，循環(huán)30次，最后72 ℃ 7 min循環(huán)1次。

焦磷酸測(cè)序和數(shù)據(jù)分析：使用454 FLX高通量測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。使用EzTaxon-e 數(shù)據(jù)庫(kù)、強(qiáng)大的全球成對(duì)測(cè)序比對(duì)及BLASTN搜索工具（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLASTN）進(jìn)行細(xì)菌高質(zhì)量reads的分類分配。未能與EzTaxon-e數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的序列（>97 %）進(jìn)行二次處理，使用UCHIME程序檢查嵌合序列。使用CD～HIT程序在97 %相似度水平生成操作分類單元（OTU）。采用Mothur

程序包計(jì)算香農(nóng)多樣性指數(shù)、Chao1豐度指數(shù)和Goods庫(kù)覆蓋率。

2　統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS一般線性模型過(guò)程對(duì)惡臭化合物數(shù)據(jù)進(jìn)行完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)方差分析。使用鄧肯氏多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行惡臭化合物濃度和細(xì)菌種類豐度關(guān)系分析。所有測(cè)定變量的顯著性水平為P<0.05。

未完待續(xù)

原題名：Effect of Dietary Protein Levels on Composition of Odorous Compounds and Bacterial Ecology in Pig Manure （英文）

原作者： Sungback Cho（韓國(guó)農(nóng)村發(fā)展局國(guó)家動(dòng)物科學(xué)研究所）

中圖分類號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C

文章編號(hào)：1001-0769（2016）06-0051-02

*譯者簡(jiǎn)介：張江，男，上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授。