譚擁軍，陳竹林，陳團輝，向　勤

(湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長沙　410082)

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人FOXA1蛋白的原核表達、純化及蛋白互作分析*1

譚擁軍?，陳竹林，陳團輝，向勤

(湖南大學(xué) 生物學(xué)院，湖南 長沙410082)

摘要：構(gòu)建FOXA1的原核表達載體，誘導(dǎo)表達并純化后獲得人FOXA1的C端和N端蛋白片段，為尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎(chǔ).提取人乳腺癌細胞MCF7的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計引物PCR克隆FOXA1的cDNA，再以此為模板擴增FOXA1的C端、N端cDNA片段，分別并克隆進帶有GST標(biāo)簽的原核表達載體pGEX-4T-1，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒.雙酶切及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 Rosetta DE3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，Glutathione Sepharose 4B親和純化，通過SDS-PAGE電泳及Western blot確定FOXA1蛋白的表達.與MCF7細胞裂解液孵育，進行GST-Pull down試驗，檢測純化蛋白與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功構(gòu)建pGEX-4T-1-FOXA1-C和 pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表達載體；在大腸桿菌中誘導(dǎo)目的蛋白表達；經(jīng)Glutathione Sepharose 4B純化后，獲得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C與N端蛋白片段GST-FOXA1-N；證實GST-FOXA1-C能與FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子FOXA1；原核表達；相互作用蛋白

轉(zhuǎn)錄因子FOXA1屬于叉頭框(Forkhead Box, Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族的FOXA亞家族[1].FOX基因廣泛地分布于從酵母到人的各種真核生物中，構(gòu)成一個龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族.其中在哺乳動物中就擁有40個以上成員，分別參與細胞分化、增殖、代謝及細胞凋亡等生理過程的調(diào)節(jié)[2]. FOXA1是該家族最早被克隆的成員[3].

FOXA1蛋白介導(dǎo)許多蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)發(fā)育、代謝和腫瘤的發(fā)生.FOXA1的功能區(qū)域由 DNA結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)構(gòu)成.作為先鋒轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXA1的羧基端能與核心組蛋白H3,H4相互作用[4]加強了FOXA1蛋白與核小體的結(jié)合能力.有研究表明轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 羧基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可以招募TLE3/GRG3結(jié)合到染色質(zhì)上[5].而FOXA1 DNA結(jié)合區(qū)可以干擾轉(zhuǎn)錄因子NKX2.1與DNA的結(jié)合功能從而抑制NKX2.1轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，抑制腦肺和甲狀腺的發(fā)育[6].此外，F(xiàn)OXA1的DNA結(jié)合區(qū)還介導(dǎo)FOXA1與雄激素受體(AR)的相互作用[7]，而在乳腺癌細胞株中，雌激素的應(yīng)答在一定程度上依賴于FOXA1的表達[8-9].

為了進一步研究FOXA1在細胞中扮演的角色，本研究通過基因工程技術(shù)體外構(gòu)建表達載體，誘導(dǎo)可溶性融合蛋白 GST-FOXA1-C和GST-FOXA1-N 的高效表達并親和純化.利用 GST-Pull down技術(shù)，在乳腺癌細胞MCF7中證實GST-FOXA1-C可與已知的FOXA1結(jié)合蛋白TLE3發(fā)生相互作用，證明純化蛋白結(jié)構(gòu)正確且能與其互作蛋白發(fā)生互作，為進一步尋找FOXA1的互作蛋白提供材料基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1菌種、質(zhì)粒、細胞系

大腸桿菌DH5α感受(北京鼎國)，大腸桿菌BL21 Rosetta(DE3)感受態(tài)(廣州百恩維)，質(zhì)粒pGEX-4T-1由本實驗室保存，乳腺癌細胞MCF7為本實驗室凍存.

1.2主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHI,XhoI,T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于Promega公司，DNA高保真聚合酶購于TOYOBO公司，PCR 引物由上海生工生物公司合成，Glutathione Sepharose 4B購于GE,GST抗體購于碧云天，V5抗體購于Millpore公司.

1.3重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-FOXA1-N，pGEX-4T-1-FOXA1-C的構(gòu)建及其鑒定

根據(jù)NCBI檢索到的人源FOXA1的cDNA序列以及空載體PGEX-4T-1的多克隆位點確定FOXA1的上下游引物如表1所示.上游引物為CCC GGA TCC ATG TTA GGA ACT GTG AAG，下劃線為BamH I 酶切位點，下游引物為CGC TCT AGA GGA AGT GTT TAG GAC GGG，下劃線為EcoR I 酶切位點.以人的乳腺癌細胞MCF7提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增條件為94 ℃ 2 min ；98 ℃ 10 s，68 ℃ 90 s，68 ℃ 10 min，32個循環(huán).將 PCR產(chǎn)物克隆入pGEX-4T-1質(zhì)粒中，雙酶切鑒定后送上海生工測序.以測序正確的pGEX-4T-1-FOXA1為模板，F(xiàn)OXA1-C上游引物GCG CGA ATT CAA CCA CCC GTT CTC CAT CAA，F(xiàn)OXA1-C下游引物GCG CCT CGA GTC ATT GGT AGT ACG CCG GCT CCA G；FOXA1-N上游引物GCG CGA ATT CAT GTC CTA GGC CAA CCC GG，F(xiàn)OXA1-N下游引物GCG CCT CGA GCT AGG CGT GCG GGT AGC TGC GC．分別克隆FOXA1的C端(第397到第461個氨基酸)、N端(第66到第218個氨基酸)．

表1　質(zhì)?？寺∫?/p>

1.4GST-FOXA1-C，GST-FOXA1-N融合蛋白的純化及其鑒定

將測序正確的pGEX-4T-1-FOXA1-N，pGEX-4T-1-FOXA1-C轉(zhuǎn)化入BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細胞，挑取陽性單克隆，加入含有氨芐青霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)至OD值在0.6～1.0之間，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG，32 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌液，溶菌酶酶解30 min，超聲破碎，取上清加入GST-beads室溫孵育30 min后，加入Elution Buffer洗脫，收集洗脫后的蛋白，考染和免疫印跡鑒定.

1.5GST pull down

MCF-7細胞培養(yǎng)至60%～90%時，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染帶V5標(biāo)簽的TLE3真核表達質(zhì)粒，48 h后收集轉(zhuǎn)染后的細胞，加入500 μL IP裂解液冰上裂解1 h，13 000 r/min，4 ℃，離心15 min，收集上清，即為總的細胞裂解液.向收集的細胞裂解液中加入20 μL GST-beads，4 ℃，孵育2 h，離心收集上清，一分為二，分別加入20 μL GST-beads和純化后的GST-FOXA1-C，GST-FOXA1-N蛋白，4 ℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h，4 000 r/min離心收集珠子，用預(yù)冷的GST Lysis Buffer漂洗3次，加入Elution Buffer洗脫，收集洗脫后的蛋白，進行考染和免疫印跡鑒定.

2結(jié)論

2.1人FOXA1基因全長的擴增

MCF7細胞 RNA的提取按照Total RNA KitI試劑盒(Omega,USA)進行，運用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen,USA)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.通過NCBI查詢?nèi)薋OXA1的cDNA序列設(shè)計一對引物，再以cDNA為模板PCR擴增人的FOXA1全長(圖1)所示，通過PCR擴增出來的FOXA1 cDNA大小為1 400 bp左右，與NCBI查詢的大小基本一致.

M1：DNA Maker；M2：DNA Maker；

2.2重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-FOXA1-N，pGEX-4T-1-FOXA1-C的構(gòu)建

再以此為模板擴增FOXA1-C/FOXA1-N,大小分別為196 kb,459 kb，與預(yù)期大小一致.將PCR克隆獲得的片段克隆至表達載體PGEX-4T-1，進行雙酶切鑒定如圖2所示.我們已經(jīng)討論了FOXA1的結(jié)構(gòu)域蛋白在生物體內(nèi)發(fā)揮了重要作用，為了進一步研究其在生物體內(nèi)的功能，所以克隆出人FOXA1的羧基端和氨基 端蛋白，為后續(xù)試驗奠定材料基礎(chǔ).

(a)：M1：DNA Maker; M2:DNA Maker; 1：GST-FOXA1-C;2：GST-FOXA1-C單酶切;3：GST-FOXA1-C雙酶切.(b)：M1：DNAMaker; M2：DNA Maker; 1：GST-FOXA1-N; 2：GST-FOXA1-N單酶切; 3：GST-FOXA1-N雙酶切

圖2重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.2Restriction enzyme digestion

by PCR GST-FOXA1-C/GST-FOXA1-N

2.3GST-FOXA-C及GST-FOXA1-N融合蛋白的表達及鑒定

將pGEX-4T-1，pGEX-4T-1-FOXA1-N，pGEX-4T-1-FOXA1-C 3個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆大規(guī)模培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌液，Western blot法檢測顯示，GST-FOXA-C及GST-FOXA1-N融合蛋白均能有效表達(圖3).

1：Maker；2：GST蛋白； 3：GST-FOXA1-C誘導(dǎo)前；

2.4GST-FOXA-C與GST-FOXA1-N融合蛋白的純化

將pGEX-4T-1，pGEX-4T-1-FOXA1-N，pGEX-4T-1-FOXA1-C 3個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進BL21 Rosetta DE3感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆大規(guī)模培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌液，酶解，超聲破碎.上清用GST-Sepharose4B親和珠純化后，經(jīng)考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示，雖出現(xiàn)不同程度的降解，但均能有效地獲得較高濃度的目的GST-FOXA-C及GST-FOXA1-N融合蛋白(圖4).

圖4　GST-FOXA1-C和GST-FOXA1-N

2.5GST-pull down結(jié)果分析

將帶有GST-FOXA1-C與GST-FOXA1-N融合蛋白的珠子與過表達的V5-TLE3蛋白的MCF7細胞裂解液孵育后，用V5抗體進行Western blot 法檢測(圖5)結(jié)果顯示，GST-FOXA1-C融合蛋白可以與TLE3 蛋白發(fā)生結(jié)合，而GST蛋白和GST-FOXA1-N融合蛋白在同一位置無此條帶，說明FOXA1-C端蛋白結(jié)構(gòu)域能夠有效的與TLE3 蛋白特異地相互作用，具有與FOXA1全長蛋白部分相似的生物學(xué)功能.

1：過表達V5-TLE3蛋白的MCF7細胞裂解物(Input)；2:GST蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物；3：GST-FOXA1-N融合蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物；4：GST-FOXA1-C融合蛋白與Input孵育后的Pull down產(chǎn)物

圖5Pull down產(chǎn)物Western blot分析

Fig.5Pull down analysis of SDS-PAGE

and Western blot analysis of the product

2.6Pull down結(jié)果的考馬斯亮藍分析

將帶有GST-FOXA1-C融合蛋白的珠子與MCF7細胞裂解液孵育后，同時用GST蛋白與MCF7細胞裂解液孵育的結(jié)果作為對照，再用洗脫液將Pull down產(chǎn)物洗脫下來，經(jīng)考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn)，GST-FOXA1-C融合蛋白能夠拖下許多與FOXA1-C端相結(jié)合的互作蛋白,從而為后面的實驗奠定材料基礎(chǔ)(圖6).

1：Protein Maker；2：Input：MCF7 cell lysis；3：對照組GST Pull down 洗脫產(chǎn)物；4：對照組 GST Pull down 上清；5：實驗組GST-FOXA1-C Pull down洗脫產(chǎn)物；6：實驗組GST-FOXA1-C洗脫上清；7：GST-FOXA1-C蛋白；8：GST蛋白

圖6GST-FOXA1-C融合蛋白

Pull down結(jié)果的考馬斯亮藍分析

Fig.6GST-FOXA1-C fusion protein Pull down

analysis of SDS-PAGE of the product

3討論

GST Pull down技術(shù)是體外確定兩個已知蛋白是否相互作用以及篩選與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白的有效方法. 本實驗成功構(gòu)建GST-FOXA1結(jié)構(gòu)域蛋白的表達載體，這種構(gòu)建基因的某一段的結(jié)構(gòu)域蛋白研究其生物功能并不少見，有文章報道過構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子FOXO基因的結(jié)構(gòu)域蛋白研究它與目的蛋白的甲基化作用[10].再摸索誘導(dǎo)條件后以比較優(yōu)化的條件誘導(dǎo)出GST-FOXA1-C和GST-FOXA1-N融合蛋白，作為后續(xù)試驗的誘餌蛋白.將高表達V5-TLE3的MCF7細胞裂解液中與GST-FOXA1-C誘餌蛋白以最佳時間孵育后，成功捕捉與其已知的結(jié)合蛋白TLE3，證實實驗制備的融合蛋白具有生物活性.隨后再次在MCF7裂解中以GST-FOXA1-C為誘餌蛋白進行GST Pull down，將產(chǎn)物進行SDS-PAGE后考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn)成功捕捉到相互作用的蛋白.

FoxA1是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，該轉(zhuǎn)錄因子屬于“螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋”類蛋白的一個亞群.Fox家族蛋白功能涉及胚胎發(fā)育、細胞周期調(diào)控、糖類和脂類代謝、生物老化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程, 其突變和表達異常與發(fā)育畸形、代謝性疾病以及腫瘤發(fā)生有關(guān)[11-12].已有文章得出結(jié)論FOXA1與TLE3在乳腺癌中相互作用，本文通過進行GST Pull down成功驗證這一結(jié)論并證實制備的蛋白具有生物活性.

TLE基因最早在1968年被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已知的家族成員共有19個[13]，是典型的轉(zhuǎn)錄輔助抑制因子家族蛋白.在哺乳動物中，它包括TLE(transducin-like enhancer of split)1～4(人類).Gro / TLE蛋白家族不能直接與DNA結(jié)合，而是被各種不同類型的轉(zhuǎn)錄因子所招募[14].有研究證實轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 羧基端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)可以招TLE3/GRG3結(jié)合到染色質(zhì)上.本實驗通過利用GST-FOXA1-C與TLE3的體外相互作用驗證兩者相互作用.

乳腺癌現(xiàn)已成為人類的一大殺手，越來越多的研究證明FOXA1在乳腺癌中發(fā)揮了重要的作用，使其有望成為腫瘤治療的新靶點[15-16].本文成功克隆了人的FOXA1,FOXA1-C,FOXA1-N基因并獲得有活性的人FOXA1-C和FOXA1-N蛋白，為后續(xù)進一步尋找FOXA1的互作蛋白和制備抗體奠定了良好的基礎(chǔ).

參考文獻

[1]KAESTNER K H, KNOCHEL W,MARTINEZ D E. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors[J]. Genes Dev, 2000,14(2): 142-146.

[2]HANNENHALLI S, KAESTNER K H. The evolution of fox genes and their role in development and disease[J]. Nat Rev Genet, 2009,10(4): 233-240.

[3]LAI E.HNF-3A, a hepatocyte-enriched transcription factor of novel structure is regulated transcriptionally[J]. Genes Dev, 1990,4(8):1427-1436.

[4]CIRILLO L A.Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4[J]. Mol Cell, 2002,9(2): 279-289.

[5]SEKIYA T,ZARET K S.Repression by Groucho/TLE/Grg proteins: genomic site recruitment generates compacted chromatin in vitro and impairs activator binding in vivo[J]. Mol Cell, 2007,28(2): 291-303.

[6]MINOO P．Physical and functional interactions between homeodomain NKX2.1 and winged helix/forkhead FOXA1 in lung epithelial cells[J]. Mol Cell Biol, 2007,27(6): 2155-2165.

[7]GAO N.The role of hepatocyte nuclear factor-3 alpha (Forkhead Box A1) and androgen receptor in transcriptional regulation of prostatic genes[J].Mol Endocrinol,2003,17(8):1484-1507.

[8]CARROLL J S.Chromosome-wide mapping of estrogen receptor binding reveals long-range regulation requiring the forkhead protein FOXA1[J]. Cell, 2005:122(1): 33-43.

[9]LUPIEN M.FOXA1 translates epigenetic signatures into enhancer-driven lineage-specific transcription[J].Cell,2008,132(6):958-70.

[10]YAMAGATA K.Arginine methylation of FOXO transcription factors inhibits their phosphorylation by Akt[J].Mol Cell, 2008,32(2): 221-231.

[11]TAN Y,RAYCHAUDHURI P,COSTA R H.Chk2 mediates stabilization of the FoxM1 transcription factor to stimulate expression of DNA repair genes[J]. Mol Cell Biol, 2007,27(3):1007-1016.

[12]LEHMANN O J.Fox's in development and disease[J]. Trends Genet,2003,19(6):339-344.

[13]CHEN G,COUREY A J.Groucho/TLE family proteins and transcriptional repression[J]. Gene, 2000,249(1/2): 1-16.

[14]FISHER A L,CAUDY M.Groucho proteins: transcriptional corepressors for specific subsets of DNA-binding transcription factors in vertebrates and invertebrates[J]. Genes Dev,1998,12(13):1931-1940.

[15]CANCER Genome Atlas N． Comprehensive molecular portraits of human breast tumours[J]. Nature,2012,490(7418): 61-70.

[16]LEHMANN B D.Identification of human triple-negative breast cancer subtypes and preclinical models for selection of targeted therapies[J]. J Clin Invest,2011,121(7): 2750-2767.

Prokaryotic Expression, Purification, and Protein-interaction Analysis of Human FOXA1 Protein

TAN Yong-jun?，CHEN Zhu-lin，CHEN Tuan-hui，XIANG Qin

(College of Biology，Hunan Univ，Changsha，Hunan410082，China)

Abstract:To identify proteins interacting with transcription factor FOXA1，different prokaryotic expression vectors for human FOXA1 protein were constructed and the proteins of FOXA1 C-terminus and FOXA1 N-terminus were purified. They provided a material foundation for future studies of FOXA1-interacted proteins. Total RNAs were extracted from human breast cancer MCF7 cells and reverse transcribed into cDNAs. The full length cDNA of FOXA1 was amplified by PCR, and the C-terminal and N terminal segments were also amplified respectively. The different FOXA1 cDNA fragments were cloned into a prokaryotic expression vector pGEX-4T-1. The correct vectors were confirmed by double restriction enzyme digestion and DNA sequencing and transformed into E. coli BL21 Rosetta DE3. The FOXA1 proteins were purified with Glutathione Sepharose 4B and analyzed through SDS-PAGE electrophoresis and Western blot. GST Pull-down experiments were performed with lysates of MCF7 cells and FOXA1 proteins to test the interaction between FOXA1 and a known FOXA1-interacted protein TLE3.Prokaryotic expression vectors of pGEX-4T-1-FOXA1-C and pGEX-4T-1-FOXA1-N were constructed successfully. The proteins of FOXA1 C-terminus (GST-FOXA1-C) and FOXA1 N-terminus (GST-FOXA1-N) were purified by Glutathione Sepharose 4B. It was confirmed that the purified GST-FOXA1-C was able to interact with the known FOXA1-interacted protein TLE3 in the Pull-down experiment.

Key words:transcrition factor FOXA1; prokaryotic expression; interaction protein

文章編號：1674-2974(2016)06-0104-05

收稿日期：2015-08-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81472718)，National Natural Science Foundation of China(81472718)

作者簡介：譚擁軍(1967-)，男，湖南長沙人，湖南大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師 ?通訊聯(lián)系人，E-mail:yjtan@hnu.edu.cn

中圖分類號：Q786

文獻標(biāo)識碼：A