沈 頔, 邢 新, 楊 超, 戴海英, 徐建國(guó), 王曉云

作者單位：200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 整形外科

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論著-瘢痕研究專題

環(huán)孢素A對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響

沈 頔, 邢 新, 楊 超, 戴海英, 徐建國(guó), 王曉云

作者單位：200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 整形外科

目的 研究環(huán)孢素A對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法 用環(huán)孢素A作用于體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成纖維細(xì)胞凋亡率，DAPI 染色觀察成纖維細(xì)胞的凋亡形態(tài)，CCK-8比色法檢測(cè)環(huán)孢素A對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度。結(jié)果 隨著環(huán)孢素A濃度增高，成纖維細(xì)胞凋亡率不斷增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過數(shù)據(jù)分析獲得的半數(shù)抑制濃度為(1.908±0.280) g/L。結(jié)論 環(huán)孢素A對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并有望在瘢痕疙瘩的防治中發(fā)揮重要作用。

瘢痕疙瘩； 環(huán)孢素A； 成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞增殖

瘢痕疙瘩是一種臨床上常見的纖維組織增生性疾病，是皮膚對(duì)損傷的過度反應(yīng)。其主要的病理變化是成纖維細(xì)胞的過度增生及膠原蛋白的過度增殖及沉積[1]。目前對(duì)于瘢痕疙瘩還沒有一種完全徹底有效的治療方法，但瘢痕疙瘩內(nèi)藥物注射始終是一種重要的治療方式。使用的藥物多為抑制膠原蛋白沉積及成纖維細(xì)胞增殖，如曲安奈德、5-氟尿嘧啶等。環(huán)孢素A因其強(qiáng)大的抑制膠原形成及抑制細(xì)胞增殖作用而被廣泛用于器官移植的抗排異中[2]。自2015年2～10月，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院整形外科對(duì)環(huán)孢素A在體外對(duì)于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行研究，以探討其在臨床治療上應(yīng)用的可行性。

1 對(duì)象與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院整形外科及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科的7例手術(shù)瘢痕疙瘩標(biāo)本(臀部、肩部各1例，耳垂2例，胸前3例)，患者均無系統(tǒng)性疾病及激素、藥物注射史。對(duì)用于實(shí)驗(yàn)的所取組織患者均知情同意。手術(shù)臺(tái)上獲取標(biāo)本后，用手術(shù)刀將瘢痕切成適當(dāng)大小的組織塊。在超凈臺(tái)上，削取1 mm厚的瘢痕疙瘩組織片，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)。待細(xì)胞基本爬滿瓶底后，以0.2%胰蛋白酶消化，按1∶2分瓶培養(yǎng)[3]。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)所要處理的環(huán)孢素A濃度不同分為3組，分別加入0.5、1.0、2.0 g/L濃度的環(huán)孢素A。每組設(shè)置一組陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。

1.3 Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成纖維細(xì)胞凋亡率 將3、4代細(xì)胞按1×105/ml，每孔3 ml接種到6孔板上，設(shè)對(duì)照孔。培養(yǎng)72 h后，棄上清液，用0.2%胰酶消化。每個(gè)標(biāo)本收集約1×105個(gè)細(xì)胞。分別加入AnnexinV-FITC 2.5 μl和PI 2.5 μl后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 DAPI染色觀察成纖維細(xì)胞的凋亡形態(tài) 將3、4代細(xì)胞按照1×105/ml，每孔3 ml，接種于預(yù)先鋪好玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)對(duì)照孔。培養(yǎng)72 h后，取出載玻片，按分組分別加入條件養(yǎng)液5 ml。培養(yǎng)24 h,依次加入1∶3的冰醋酸+甲醇固定液2 ml和1 μg/ml的DAPI染液2 ml，避光90 min染色。玻片翻轉(zhuǎn)倒置在載玻片上，滴加檸檬酸緩沖液(pH 5.5)數(shù)滴，封固后熒光顯微鏡下觀察。

1.5 CCK-8比色法檢測(cè)環(huán)孢素A對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響并計(jì)算半數(shù)抑制濃度 將3、4代細(xì)胞按照1×105/ml，每孔100 μl，接種到96孔板上，設(shè)置陰性對(duì)照組(不加藥孔)和空白對(duì)照組(加入PBS)。孵育72 h后，每組分別加入條件養(yǎng)液24 h后，依次加入CCK-8液10 μl。用自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm(參考波長(zhǎng)為650 nm)時(shí)的吸光度A值，計(jì)算抑制率。并使用SPSS 18.0軟件分析其半抑制濃度(IC50值)。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率 0.5、1.0、2.0 g/L濃度的藥物處理24 h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀定量顯示，細(xì)胞凋亡率分別為(26.90±6.51)%、(74.80±9.56)%、(77.00±16.30)%，組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組(2.86±2.18)%比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 DAPI熒光染色 對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)見細(xì)胞染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡細(xì)胞(圖1)；實(shí)驗(yàn)組見凋亡細(xì)胞的核染色質(zhì)高度凝集，邊緣化，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體(圖2)。

2.3 CCK-8比色法檢測(cè)環(huán)孢素A對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響并計(jì)算半數(shù)抑制濃度 經(jīng)0.5、1.0、2.0 g/L的環(huán)孢素A干預(yù)24 h后，各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，半數(shù)抑制濃度IC50為(1.908±0.280) g/L。

3 討論

目前治療瘢痕疙瘩的常見方法有手術(shù)切除[4]、藥物注射等，其常用的注射藥物有曲安奈德[5]、干擾素、5-氟尿嘧啶等。環(huán)孢素A是一種傳統(tǒng)的免疫抑制藥物。環(huán)孢素A進(jìn)入細(xì)胞后，與胞漿中的一種受體親環(huán)蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物。該形成的復(fù)合物可作用于細(xì)胞內(nèi)的磷脂化酶-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，從而抑制若干細(xì)胞因子，如 IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF的產(chǎn)生和釋放，并抑制IL-2受體的表達(dá)[6]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β是一種對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)合成及傷口愈合具有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子。其被證明是導(dǎo)致纖維化的主要因素之一[7]。在瘢痕疙瘩中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β濃度異常升高。抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β的生物活性可以抑制基質(zhì)生成和凋節(jié)纖維化過程[8]。環(huán)孢素A可能通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β而發(fā)揮一定的抗纖維化作用。有相關(guān)研究表明，同為免疫抑制劑的他克莫司，可以通過該途徑抑制瘢痕疙瘩的增殖[9]。

圖1 DAPI熒光染色對(duì)照組 圖2 DAPI熒光染色實(shí)驗(yàn)組

表1 不同濃度環(huán)孢素A作用24 h對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響

組別吸光度抑制率0．5mg/ml組0．2530±0．10800．261．0mg/ml組0．1830±0．01500．472．0mg/ml組0．1820±0．02200．47 對(duì)照組0．3450±0．10300 空白對(duì)照組0．0083±0．00251

細(xì)胞凋亡在維持機(jī)體內(nèi)在平衡方面起非常重要的作用。學(xué)者推論在瘢痕的發(fā)生與創(chuàng)傷修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞正常凋亡的障礙使成纖維細(xì)胞增殖，分泌過多的膠原和細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致病理性瘢痕發(fā)生[10]。正常情況下，組成機(jī)體的細(xì)胞本身處在不斷地更新中。這種更新是一種動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間的平衡是機(jī)體穩(wěn)態(tài)的基本條件，成纖維細(xì)胞過度增殖或凋亡減少就會(huì)導(dǎo)致病理性瘢痕的產(chǎn)生[11]。環(huán)孢素A可以通過促使過度增殖的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡來發(fā)揮一定的抗纖維化作用。

筆者通過CCK-8比色法發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A在體外對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞有明顯的抑制作用(P<0.01)，且具有明顯濃度依賴性。通過采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率隨之升高。通過DAPI熒光染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)，實(shí)驗(yàn)組可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)；而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)間細(xì)胞染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡細(xì)胞。

目前瘢痕疙瘩發(fā)生變化機(jī)制還不完全明確[12]。總結(jié)近年來多數(shù)學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，我們猜測(cè)環(huán)孢素A治療瘢痕的主要作用機(jī)制可能有:⑴抑制成纖維細(xì)胞增殖。⑵降低成纖維細(xì)胞膠原合成和分泌能力。⑶誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡。⑷抑制瘢痕內(nèi)局部血管增生。本研究采用較低濃度環(huán)孢素A干預(yù)體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并發(fā)現(xiàn)存在明顯的濃度依賴性。為了減少藥物可能的毒副作用，并且為了獲得較好效果，我們推薦的半數(shù)抑制濃度為(1.908±0.280) g/L。

綜上所述，體外環(huán)孢素A對(duì)以瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的作用較為明顯，但對(duì)于其在人體內(nèi)治療瘢痕疙瘩的效果仍有待于進(jìn)一步地研究。

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Effects of Cyclosporin A on the proliferation and apoptosis of fibroblasts in keloids

SHENDi,XINGXin,YANGChao,DAIHai-ying,XUJian-guo,WANGXiao-yun.

(DepartmentofPlasticSurgery,ChanghaiHospitalAffiliatedtheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

XINGXin,Email:xingxin56@yahoo.com.cn

Objective To study the biological effect of Cyclosporin A on the proliferation and apoptosis of fibroblasts in keloids. Methods Cyclosporine A was used on cultured keloid fibroblasts, then we Annexin V-FITC/PI flow cytometry, DAPI staining and CCK-8 colorimetric were used to detect the rate of fibroblast apoptosis, the apoptotic fibroblasts form and the half inhibitory concentration, respectively. Results With the increased concentration of Cyclosporin A, the apoptosis rate of fibroblasts constantly increased with a statistically significant difference. Data analysis was obtained by the half inhibitory concentration (1.908±0.280) g/L. Conclusion Cyclosporin A inhibits the proliferation of fibroblasts in keloids and is expected to play an important role in the prevention of keloids.

Keloids; Cyclosporin A; Fibroblasts; Cell apoptosis; Cell proliferation

沈 頔(1983-)，男，上海人，主治醫(yī)師，博士研究生.

邢 新，200433，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院 整形外科，電子信箱:xingxin56@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.11.002

R619.6

A

1673-7040(2016)11-0645-03

2016-08-13)