于國寧， 白雪濤， 白艷潔

作者單位：110016 遼寧 沈陽，遼寧省人民醫(yī)院 (骨外科：于國寧，口腔正畸科：白艷潔)；中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 麻醉科(白雪濤)

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實驗研究

前列腺素E2與羥基磷灰石雜化對成骨樣細胞株MC3T3-E1凋亡的影響

于國寧， 白雪濤， 白艷潔

作者單位：110016 遼寧 沈陽，遼寧省人民醫(yī)院 (骨外科：于國寧，口腔正畸科：白艷潔)；中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 麻醉科(白雪濤)

目的 探討前列腺素E2與羥基磷灰石雜化對成骨樣細胞株MC3T3-E1凋亡的影響。方法 以無添加物培養(yǎng)基、終濃度為0.031 25 mg/ml的羥基磷灰石作為對照組，不同濃度的前列腺素E2、前列腺素E2+羥基磷灰石(羥基磷灰石終濃度為0.031 25 mg/ml，平均粒徑為228.9 nm；前列腺素E2濃度分別為0.0125、0.0500、0.2000、0.8000，3.2000、12.8000 μmol/L)為實驗組，與成骨樣細胞株MC3T3-E1孵育，分別于不同時間，用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。結果 在6 d內，0.031 25 mg/ml的羥基磷灰石對MC3T3-E1細胞的凋亡無影響，隨時間延長，促進凋亡發(fā)生，具有時間依賴性。0.0125 μmol/L的前列腺素E2+羥基磷灰石對MC3T3-E1細胞的凋亡具有抑制作用，但明顯低于相同濃度的前列腺素E2，0.0500 μmol/L的前列腺素E2+羥基磷灰石對MC3T3-E1細胞的凋亡無明顯抑制作用；0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的前列腺素E2+羥基磷灰石對MC3T3-E1細胞的凋亡具有一定的促進作用，并高于相同濃度的前列腺素E2(P<0.05)，且具有時間和劑量依賴性。結論 濃度為0.031 25 mg/ml、平均粒徑為228.9 nm的羥基磷灰石對MC3T3-E1凋亡無影響，安全時間為6 d左右，之后促進凋亡發(fā)生，具有時間依賴性；其與低濃度前列腺素E2雜化，抑制MC3T3-E1凋亡，與高濃度前列腺素E2雜化，促進MC3T3-E1凋亡并具有時間和劑量依賴性。

前列腺素E2; 羥基磷灰石; 成骨樣細胞; 細胞凋亡

本系列實驗之一是在制備PGE2-PLGAMSs緩釋微球基礎上，進一步行PGE2-PLGAMSs-HAP雜化凝膠的制備研究。由于 PGE2的雙向濃度調節(jié)效應，我們需明確具有骨誘導作用的HAP與PGE2雜化后，能否如預期在PGE2低濃度時增強成骨，或高濃度時弱化骨吸收，即減少凋亡率，以及理想的HAP粒徑大小，懸浮液中的安全濃度等。因此，自2015年1～6月，遼寧省人民醫(yī)院探討前列腺素E2與HAP雜化對成骨樣細胞株MC3T3-E1凋亡的影響，以期為后續(xù)實驗設計提供正確的指導及明確的觀察指標。

1 實驗材料

1.1 主要儀器 HeRA CellCO2恒溫培養(yǎng)箱 (德國KENDRO公司)、Tecan Sunrise型酶標儀(奧地利TECAN公司)、CK40型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、5804 R型低溫高速離心機和200 μl、1 ml移液器(德國EPPENDORF公司)、SW-CT-IF型超凈工作臺(中國上海博訊公司)、BP 211D型電子天平(德國SARTORIUS公司)、Series 1000型超低溫冰箱(美國KELVINATOR公司)、Tecan Sunrise全自動酶標儀(奧地利TECAN公司)，Delta 320型pH酸度儀(德國METTLER TOLEDO公司)、RCT Basic恒溫磁力攪拌器(德國IKA公司)、SHZ-88型恒溫水浴箱(中國江蘇太倉公司)、FACSCalibur 流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 主要試劑 MEM培養(yǎng)基、MTT和TritonX-100(美國SIGNA公司)，小牛血清白蛋白(BSA，美國XIASI公司)，胎牛血清(美國HYCLONE公司)，OriCellTM小鼠成骨誘導培養(yǎng)液(美國CYAGEN BIOSCIENCES公司)，二甲基亞砜、EDTA、Trito-X100(中國北京華美生物工程公司)，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2；中國武漢三洹公司)，HAP(沈陽藥科大學自制)。

2 實驗方法

2.1 成骨細胞株MC3T3-E1的細胞培養(yǎng) 將小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆 14[MC3T3-E1 Subclonel4,購自中國科學院上海細胞庫(ATCC CRL-2594)]按每瓶3×105個培養(yǎng)于100 ml 10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2孵箱(飽和濕度95%、5%CO2、37℃)孵育。根據(jù)細胞生長狀況以及培養(yǎng)液的pH值變化，1～2 d換液1次，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時傳代。

2.2 成骨樣細胞株MC3T3-E1的傳代培養(yǎng) 當MC3T3-E1細胞株生長形成單層，鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時，在無菌條件下傳代。用D-Hank′s液清洗鋪滿細胞的培養(yǎng)瓶后，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 0.5 ml，室溫下3～5 min，見瓶底出現(xiàn)針孔樣透明時，吸去胰酶，加入含10%小牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液，吹打細胞制成細胞懸液，按1∶3傳代，置于CO2孵箱，每2 d換液1次。

2.3 成骨樣細胞株MC3T3-E1的凍存和復蘇 將鋪滿100 ml培養(yǎng)瓶的MC3T3-E1細胞用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化收集后，加入1 ml凍存液(含40%DMEM、50%小牛血清、5%DMSO、5%甘油)，吸入凍存管，分4個階段從4℃～-196℃緩慢放入液氮罐內長期保存(約1℃/min)。細胞復蘇時，采用快速復溫法，將液氮中凍存的裝有MC3T3-E1細胞的凍存管取出后，立即置于37℃水浴中復溫，融化后，立即以DMEM培養(yǎng)液1500 r/min，離心10 min，清洗3次,再接種于細胞培養(yǎng)瓶，并置于CO2孵箱內培養(yǎng)。

2.4 HAP與PGE2雜化對小鼠成骨樣細胞株MC3T3-E1細胞凋亡的影響 ⑴將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞用0.25%胰蛋白酶-0.02-EDTA消化后，加入10%FCS的MEM培養(yǎng)液,制成2×105細胞懸液加于12孔培養(yǎng)板中，每孔1 ml。待細胞鋪滿孔底后，分別將OriCellTM小鼠成骨誘導培養(yǎng)液稀釋的不同濃度(0.0125、0.0500、0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L)PGE2、PGE2+HAP(HAP終濃度為0.031 25 mg/ml)加于24孔培養(yǎng)板中，2個對照組分別添加等量的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1/2。分別于第4、 6、 8、 10天取出，用Annexin V-PI 雙染色法檢測細胞凋亡。⑵用不含EDTA的胰酶消化各實驗組細胞，吹打制成單細胞懸液，加入10 ml離心管中。⑶加入預冷的無鈣、鎂離子的PBS緩沖液，1000 r/min，離心5 min，洗滌2次，棄上清。⑷加入孵育緩沖液進行，1000 r/min，離心5 min。⑸加入100 μl 標記溶液重新懸浮細胞，避光條件下孵育15 min。⑹重復步驟3。⑺加入熒光溶液，4℃下避光孵育20 min。⑻采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

3 結果

3.1 前列腺素E2與HAP雜化對成骨樣細胞株MC3T3-E1凋亡的影響 PGE2作用成骨細胞10 d后，用流式細胞儀檢測其凋亡發(fā)生率。結果顯示，0.031 25 mg/ml的HAP能促進MC3T3-E1細胞凋亡(P<0.05)。HAP與PGE2雜化對成骨細胞凋亡作用是雙相的；與低劑量(0.0125 μmol/L)的PGE2雜化對成骨細胞增殖作用較強，凋亡發(fā)生率較低(P<0.05)；而與高劑量(3.2000 μmol/L)的PGE2雜化則抑制成骨細胞增殖，促進細胞凋亡(圖1)。

3.2 HAP與PEG2雜化對成骨細胞凋亡的影響 實驗結果顯示，0.031 25 mg/ml HAP在第4、6天時，對MC3T3-E1細胞的凋亡無影響，在第8、10天時，具有一定的促進作用(P<0.05)，且具有時間依賴性。0.0125 μmol/L的PGE2+HAP在第4、6天時，與對照組及實驗組相比，對細胞凋亡無明顯影響；在第8、10天時，對MC3T3-E1細胞的凋亡具有抑制作用，但明顯低于相同濃度的PGE2；0.0500 μmol/L的PGE2+HAP在第4天時，對凋亡有促進作用，第6、8、10天時，與空白組比較促進凋亡，但與HAP組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；0.0500 μmol/L PGE2組對凋亡無影響。0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的PGE2+HAP在4個時間點對MC3T3-E1細胞凋亡均有促進作用，其促進作用明顯高于相同濃度的PGE2(P<0.05)或HAP對照組，且具有劑量和時間依賴性。

統(tǒng)計分析結果提示，0.031 25 mg/ml HAP隨時間延長，促進MC3T3-E1細胞凋亡(P<0.05)，且具有時間依賴性。0.0125 μmol/L的PGE2與HAP雜化隨時間延長，抑制MC3T3-E1細胞的凋亡。0.0500 μmol/L PGE2與HAP雜化，與等濃度的PGE2相比，促進凋亡，與HAP組比較，對凋亡無影響。而0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的PGE2與HAP雜化，則抑制成骨細胞增殖，促進細胞凋亡，且具有時間、劑量依賴性(圖2)。

4 討論

本研究通過預研究設定了6個濃度，即0.0125、0.0500、0.2000、0.8000、3.2000、12.8000 μmol/L的PGE2分別處理MC3T3-El 成骨細胞后，結果顯示，PGE2與HAP雜化對成骨細胞凋亡的作用是雙相的。這與前期研究PGE2對成骨細胞生物學性能及凋亡的雙向調控的結論是一致的。即HAP的加入，未改變PGE2的雙向調控特性。本研究HAP與低濃度PGE2雜化，減弱了抑制MC3T3-E1細胞凋亡作用；與高濃度PGE2雜化，促進凋亡，放大了促進作用。

本研究HAP粒徑范圍為90.0～1000.0 nm，平均粒徑為228.9 nm,懸浮液濃度為0.03125 mg/ml。預研究顯示,對MC3T3-E1細胞增殖無影響。而本研究HAP在組織液中第4、6天時，對細胞凋亡無影響，而第8、10天時，促進凋亡。推測HAP可能隨時間改變出現(xiàn)生物降解，分散成更小顆粒，進而促進MC3T3-E1細胞的凋亡[1-4]。而研究報道證明，納米HAP顆粒的尺度、形貌和劑量對其生物學活性都有明顯的影響。Huang 等[5]發(fā)現(xiàn)，直徑小于100.0 nm的HAP，尤其是針狀的，可引起炎癥反應。中國科學院高能物理所發(fā)現(xiàn)：生理鹽水溶液中，尺寸小于100 nm的磁性納米顆粒，進入動物體內導致血凝現(xiàn)象，凝聚成小鼠血管大小的顆粒，阻塞小鼠血管，導致其死亡。因此，我們在利用HAP諸多優(yōu)良性能促進骨改建的同時，納米尺寸帶來的安全問題更需要我們的重視。Ding和Sun[6]研究了粒徑為30.0～80.0 nm的球形納米HAP對細胞生物學的效應，他們發(fā)現(xiàn)，納米材料的作用濃度與細胞活力存在明顯的正相關效應，當納米顆粒的濃度達到200.0 μg/ml時，細胞出現(xiàn)明顯的凋亡。而本研究所用濃度為0.031 25 mg/ml(相當于321.5 μg/ml)，明顯高于文獻濃度，這與劉小龍和張金超[7]的結論接近一致。本研究證明，此HAP懸浮液的濃度在6 d內是安全的，提示我們后續(xù)實驗可以參考此結果，并嚴格控制HAP的粒徑。另一可能是隨著時間的延長，懸浮液中HAP出現(xiàn)團聚。有研究證實，將20.0～100.0 nm大小的HAP加入到培養(yǎng)基后，立刻聚集成500.0～700.0 nm的團塊，細胞以主動耗能網(wǎng)格蛋白介導膜內陷形式吞噬nano-HAP[8]，并由此推論nano-HAP對細胞產生毒性可能通過2種方式，一種是吞噬了聚成團塊的nallo-HAP的吞噬泡，本身破壞細胞結構，導致細胞退行性變；另一種是naIlo-HAP經(jīng)過溶酶體部分消化后溶解，釋放鈣、磷酸根離子，達到細胞毒性濃度，導致細胞死亡。

本實驗提示我們在后續(xù)實驗中，需要繼續(xù)探索以下諸多問題，如理想的HAP安全粒徑及匹配的懸浮液濃度；如何制備粒徑均勻的HAP；HAP懸浮液隨時間延長促進凋亡的可能影響因素；如何合理利用HAP促進凋亡的作用等。而懸浮液中如何避免粒子團聚，合理使用何種分散劑將是我們后續(xù)實驗的難點。

圖1 雙變量流式細胞儀散點圖(左下象限代表活細胞，右上象限代表死細胞，右下象限代表凋亡細胞) 圖2 PGE2與HAP雜化對成骨樣細胞株MC3T3-E1凋亡的影響 a.第4天 b.第6天 c.第8天 d.第10天

Fig 1 Scatterplot of double variable flow cytometry (left lower quadrant represents the living cells, upper right quadrant shows the dead cells, the lower right quadrant represents the apoptotic cells). Fig 2 Effect of PGE2 and HA hybridization on apoptosis of osteoblast-like cell line MC3T3-E1. a. the fourth day. b. the sixth day. c. the eighth day. d. the tenth day.

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Effect of PGE2 and HA hybridization on apoptosis of osteoblast-like cell line MC3T3-E1

YUGuo-ning,BAIXue-tao,BAIYan-jie.

(DepartmentofOrthopedicSurgery,People′sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

BAIYan-jie,Email:yanjiebai2008@sina.cn

Objective To investigate the effect of prostaglandin E2 and hydroxyapatite (HPA) on the apoptosis of osteoblast-like cell line MC3T3-E1. Methods The control group consisted of a culture medium free of additives with a final concentration of 0.031 25 mg/ml HPA. The experimental group consisted of a different concentration of PGE2, PGE2+HAP (final concentration of HAP was 0.031 25 mg/ml, the average particle size of 228.9 nm; PGE2 concentrations were 0.0125, 0.0500, 0.2000, 0.8000, 3.2000, 12.8000 μmol/L). MC3T3-E1 incubated with osteoblast-like cell lines, respectively at different times. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Results In 6 days, 0.031 25 HAP mg/ml had no effect on the apoptosis of MC3T3-E1 cells, with time, to promote the occurrence of apoptosis (P<0.05). A 0.0125 mol/L concentration of PGE2+HAP on apoptosis of MC3T3-E1 cells was inhibited (P<0.05), but was significantly lower than the same concentration of PGE2. There was no obvious inhibition effect in 0.0500 μmol/L concentration of PGE2+HAP on MC3T3-E1 cell apoptosis has a certain role in 0.2000, 0.8000, 3.2000, 12.8000 mol/L concentration of PGE2+HAP on MC3T3-E1 cell apoptosis, and higher than the same concentration of PGE2 (P<0.05), in a time and dose-dependent manner. Conclusion Neither the concentration of 0.031 25 mg/ml nor the average particle size of 228.9 nm HPA had any effect on the apoptosis of MC3T3-E1. The safe time is about 6 d, after which apoptosis was promoted in a time-dependent manner with low concentrations of PGE2 hybrid, MC3T3-E1 apoptosis inhibition, and high concentrations of PGE2 hybrid. Promotion of apoptosis of MC3T3-E1 was in a time and dose-dependent manner.

Prostaglandin E2; Hydroxyapatite; Osteoblast-like cell; Apoptosis

于國寧(1977-)，男，遼寧沈陽人，副主任醫(yī)師，博士.

白艷潔，110016，遼寧省人民醫(yī)院 口腔正畸科，電子信箱：yanjiebai2008@sina.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.11.019

R318

A

1673-7040(2016)11-0701-04

2016-09-10)