張芯偽，穆乃外爾·阿卜杜克熱木，朱里里，李克梅

(新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，新疆 烏魯木齊 830052)

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新疆紫花苜蓿叢枝病分子檢測及鑒定

張芯偽，穆乃外爾·阿卜杜克熱木，朱里里，李克梅

(新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，新疆 烏魯木齊 830052)

摘要：為確定在新疆地區(qū)紫花苜蓿(Medicago sativa)上發(fā)生的疑似叢枝病的病害種類，本研究提取了193個疑似紫花苜蓿叢枝病植株的總DNA，并以報道的植原體檢測通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2/R16R2為引物對其進行了巢式PCR擴增。其中23個樣品獲得了1.2 kb的特異片段，檢出率為16.8%，確定該病害為紫花苜蓿叢枝病。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，該植原體為16SrⅤ-B亞組成員，與榆樹黃化植原體組(Elm Yellows Group，16SrⅤ)中衛(wèi)矛白化(Euonymus Whitening)植原體的同源性高達99.1%。本研究首次采用分子生物技術(shù)確定了新疆紫花苜蓿叢枝病的病原是植原體，明確了其分類地位，該結(jié)果可為該病害的早期診斷、檢測提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；叢枝?。恢苍w；巢式PCR；系統(tǒng)進化樹

紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是世界分布最廣的栽培牧草，由于其品質(zhì)優(yōu)良，適口性好，被作為主要牧草廣泛種植[1]。紫花苜蓿原產(chǎn)于小亞細亞、伊朗和外高加索一帶，在我國已有2 000多年的栽培歷史，因其營養(yǎng)豐富，適口性好，易于消化，種植廣泛，故有“ 牧草之王”之稱，在我國的主要產(chǎn)區(qū)為東北、華北、西北地區(qū)[2]，其營養(yǎng)價值遠高于小麥(Triticumaestivum)和玉米(Zeamays)，在我國奶業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮著不可或缺的作用[3]。

植原體(phytoplasma)，20世紀七八十年代被稱為類菌原體(mycoplasma-like organism，MLO)，是一類無細胞壁的由生物膜包圍的單細胞原核生物，隸屬于細菌界(Bacteria)厚壁菌門(Firmicutes)軟膜菌綱(Mollicutes)[4]，常引起植株叢枝、黃化、花變?nèi)~，使經(jīng)濟作物遭受很大的損失。至今，已發(fā)現(xiàn)發(fā)生在植物上的1 000多種病害與植原體有關(guān)，僅在我國報道的有100多種[5]。苜蓿的植原體病害在美國、加拿大、意大利及阿拉伯等國家均有發(fā)生[6-9]，苜蓿叢枝病是由植原體引起的一類病害，其感病植株矮小，枝條叢生，葉片均比正常葉片小，葉片褪綠，但植株仍能開花。在自然條件下，苜蓿叢枝病的病原植原體是通過葉蟬進行傳播的[10]。早在1991年，陳耀等[11]借助電鏡觀察到來自新疆石河子的叢枝狀苜蓿植株中有類菌原體(MLO)和類立克次氏體(RLO)的存在，但未對其進行分類鑒定研究。

近年來，隨著退牧還草工程在四川、西藏、內(nèi)蒙古、新疆等12個省(自治區(qū))的實施[12]，新疆牧草產(chǎn)量有了明顯的提高。但在新疆的苜蓿生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，新疆北部的阿勒泰、塔城、昌吉等地田間均有明顯矮化、枝條細弱、葉變小等癥狀的疑似苜蓿叢枝病病株。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1～2年草地的發(fā)病率低，僅為1%～1.5%，而4～5年草地的發(fā)病率則高達32.4%～81.7%，病株鮮重僅為健株的42%～64%，有些制種田因該病的普遍發(fā)生造成種子絕收。該病害的發(fā)生造成苜蓿種子大幅減產(chǎn)，嚴重威脅著新疆苜蓿種子生產(chǎn)的安全；造成打草田地面裸露多，草地退化嚴重，草產(chǎn)量降低。隨著分子生物學技術(shù)大量用于病原生物的鑒定，本研究對紫花苜蓿叢枝病的病原開展分子檢測，即對新疆紫花苜蓿產(chǎn)區(qū)的疑似叢枝病植株進行16S rDNA的PCR擴增、克隆和序列測定，確定新疆紫花苜蓿叢枝病的病原，從而正確認識該病害的病原種類及分類地位，以期對該病害病原生理、抗病育種等研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

病株樣品于2014年8月和2015年4月采自新疆塔城、昌吉、阿克蘇等地區(qū)，主要癥狀表現(xiàn)為叢枝、小葉，同時采集健康紫花苜蓿植株作為陰性對照，樣品均保存于-80 ℃冰箱中。棗瘋病植株樣為陽性對照，由新疆農(nóng)業(yè)大學植物病理重點實驗室提供。

1.2紫花苜蓿叢枝病植原體的分子檢測

1.2.1紫花苜蓿葉片總DNA的提取分別稱取0.1 g感病植株和健康植株的幼嫩葉片，用植物基因組DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)提取苜蓿葉片的總DNA，并將DNA置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.216S rDNA的PCR擴增及電泳檢測參照Lee等[13-14]設(shè)計的植原體16S rDNA通用引物對R16mF2/R16mR1和R16F2/R16R2序列提交深圳華大基因科技有限公司合成引物。引物序列如下：R16mF2：5’-CATGCAAGTCGAACGGA-3’， R16mR1：5’-CTTAACCCCAATCATCGAC-3’；R16F2：5’-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3’，R16R2：5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’。

以提取的苜蓿植株總DNA為模板，植原體16S rDNA通用引物R16mF2/R16mR1為引物進行直接PCR擴增。PCR反應(yīng)體系均為25 μL，包括1 μL DNA模板，0.5 μL Taq DNA聚合酶，2.5 μL 10×PCR Buffer(2.5 mmol·L-1MgCl2)，1 μL dNTP(10 mmol·L-1)，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，18 μL dd H2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將直接PCR的產(chǎn)物用dd H2O稀釋20倍作為模板，以植原體16S rDNA通用引物R16F2/R16R2為引物進行巢式PCR擴增。反應(yīng)體系同直接PCR。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并記錄。

1.316S rDNA序列的測定及分析

將巢式PCR擴增產(chǎn)物的特異目的條帶切膠，用快速凝膠回收純化試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)回收、純化，與pEASY-T1(TRANS)在25 ℃下連接25 min，再進行轉(zhuǎn)化、涂板、篩選，并將篩選到的含正確插入片段的質(zhì)粒進行序列測定，由上海生工生物工程股份有限公司完成。通過DNAMAN 8軟件將測序獲得序列與植原體16Sr各組中的各個代表性序列進行核酸同源性對比分析，再使用MEGA 5.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果與分析

2.1病株癥狀

春季苜蓿返青后即可表現(xiàn)癥狀，病株生長矮小，由 根頸基部長出大量分支，枝條細弱，叢生，葉小、圓；生長旺盛期病株高度僅有健株的1/4～1/2，葉片大小不到正常葉片的1/3，發(fā)病嚴重的不開花，發(fā)病輕的仍能開花，但開花結(jié)實少(圖1)。

圖1　新疆紫花苜蓿叢枝病癥狀

2.2PCR檢測

將疑似叢枝病樣品總DNA用引物R16mF2/R16mR1和R16F2/R16R2進行巢式PCR擴增，再電泳檢測，可觀察到約1.2 kb的目的條帶，與Lee等[13-14]的結(jié)果相同。對193個疑似紫花苜蓿叢枝病樣品進行巢式PCR，其中有23個樣品可擴增出1.2 kb的特異性目的條帶。193個樣品中有137個樣品采自北疆，56個樣品采自南疆。但檢測出的23個樣品均采自北疆，故北疆紫花苜蓿叢枝病的檢出率為16.8%，而南疆樣品并未檢出。同時，以棗瘋病植株樣為陽性對照，也有1.2 kb的特異條帶，而健康苜蓿植株和雙蒸水對照均未有特異條帶(圖2)。

2.316S rDNA的序列測定及分析

將采自新疆的兩個疑似叢枝病苜蓿植株經(jīng)過總DNA的提取、巢式PCR、PCR產(chǎn)物回收純化、克隆和序列測定,獲得的植原體16S rDNA分別為1 247和1 248 bp，其中G+C含量分別為52.6%和52.5%。新疆紫花苜蓿叢枝病植原體的16SrDNA與植原體的16SrⅤ組同源性最高，最高可達99.1%，而與其它組的同源性均低于97%(表1)。

圖2　紫花苜蓿叢枝病植原體16S rDNA巢式PCR擴增

注：M，2 000 bp Marker；1-7，疑似叢枝病樣品 ；8，棗瘋病樣品；9，健康苜蓿；10，雙蒸水空白對照。

Note: M, 2 000 bp Marker； 1-7, Samples of suspected lucerne witches’ broom； 8, Samples of jujube witches’ broom； 9, Samples of healthy lucerne； 10, ddH2O negative control.

表1　同16Sr各組代表性植原體16S rDNA基因片段的核苷酸同源性比較

2.4系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建及分析

將新疆紫花苜蓿叢枝病植原體16S rDNA序列與GenBank中登錄的植原體16Sr各組中的17個代表性序列比較，并通過MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖3)，從而進一步對比分析。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹觀察可知，新疆紫花苜蓿叢枝病植原體與榆樹黃化(EY)、棗瘋病(JWB)、苜蓿叢枝病(AWB)等16SrⅤ組的各植原體株系在同一進化枝上，確定其屬于16SrⅤ組，并且與棗瘋病(JWB-Ly)、苜蓿叢枝病(AWB)等同在16SrⅤ-B亞組。

3討論與結(jié)論

本研究利用植原體16S rDNA通用引物，對新疆紫花苜蓿叢枝病疑似植株進行巢式PCR檢測，可擴增出1.2 kb的特異條帶，測序序列均與植原體有同源性關(guān)系，且與植原體的16SrⅤ組同源性最高。證明了新疆紫花苜蓿叢枝病的病原為植原體，與劉濤等[2]的研究結(jié)果相同。從而證明巢式PCR適用于新疆紫花苜蓿叢枝病植原體的檢測，對今后的檢測提供了技術(shù)指導(dǎo)和理論論證。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹觀察可知，檢測序列屬于16SrⅤ組，并且與棗瘋病(JWB-Ly，GenBank登錄號FJ154845)、苜蓿叢枝病(AWB，GenBank登錄號JQ343221)等同源性關(guān)系最近，確定其屬于16SrⅤ-B亞組，這符合16SrⅤ-B主要分布在亞洲的觀點[4]，亦與黃槐叢枝病植原體[15](STWB，GenBank登錄號AY283184)和棗瘋病植原體[16](JWB-Aqsu Xinjiang，GenBank登錄號JN571908)屬于同一亞組。

由于植原體在植物中的含量較少，且分布不均，在試驗過程中易受到試驗條件的影響，故使用電鏡技術(shù)對植原體的檢出率較低[17]。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，給植原體的檢測提供了技術(shù)支持。其中，巢式PCR技術(shù)是植原體檢測的主要技術(shù)，一般適用于感病植株組織和介體昆蟲組織中植原體含量很少的情況，是在普通PCR的基礎(chǔ)上進行的，使植原體的檢測靈敏度在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上有一定的提高[18]。植原體病害是一種傳染性很強的植物病害。通過對植原體的檢測，可及早發(fā)現(xiàn)感病植物體內(nèi)植原體的存在，對病害的防治和深入研究植原體病理特點具有重要的意義。

圖3　用鄰接法構(gòu)建的新疆紫花苜蓿叢枝病植原體16S rDNA系統(tǒng)進化樹

植物叢枝病是常見的植原體病害，由不同組的植原體引起[19]。紫花苜蓿在我國廣泛種植，本研究發(fā)現(xiàn)新疆紫花苜蓿叢枝病和云南紫花苜蓿叢枝病的病原均為植原體，但其分類地位卻有所不同，新疆紫花苜蓿叢枝病植原體屬于16SrⅤ-B亞組，而云南紫花苜蓿叢枝病植原體屬于16SrⅠ-B亞組[2]，這說明在我國引起紫花苜蓿叢枝病的植原體有16SrⅤ-B和16SrⅠ-B兩種類型。已知新疆紫花苜蓿叢枝病與榆樹黃化、棗瘋病、衛(wèi)矛白化病等的植原體同屬于16SrⅤ組，這些屬于同一組的病害間有什么聯(lián)系，以及是否具有相互傳染性還需進一步的研究。

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(責任編輯武艷培)

Molecular detection and identification of lucerne witches broom disease in Xinjiang

Zhang Xin-wei, Munewell·Abdukrem, Zhu Li-li, Li Ke-mei

(College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

Abstract:In order to determine the pathogen species of lucerne witches broom disease in Xinjiang, 193 lucerne samples with witches broom disease symptom were detected by nested-PCR with R16mF2/R16mR1 and R16F2/R16R2 universal primers for phytoplasma, and 23 samples had positive results with 1.2 kb specific fragment, which had detection rate of 16.8% and confirmed that the disease was witches broom. The phylogenetic tree showed that this phytoplasma strain was one member of 16SrⅤ-B subgroup which had 99.1% homology with euonymus whitening phytoplasma in Elm Yellows Group. To the best of authors knowledge, this was the first study to determine phytoplasma pathogen of lucerne witches broom disease in Xinjiang and identify taxonomic status using molecular biological techniques. These results provide theoretical basis for early diagnosis and detection of lucerne witches broom disease.

Key words:Medicago sativa; witches’ broom; phytoplasma; nested-PCR; phylogenetic tree

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0577

*收稿日期：2015-10-23接受日期：2016-02-24

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)重點實驗室項目——紫花苜?！皡仓Α睜畈『Φ牟≡芯?XJDX-2012-01)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目——草地病害防治技術(shù)研究與示范(201303057)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目——新疆紫花苜蓿植原體病害的分子檢測(201510758040)

通信作者：李克梅(1973-)，女，江蘇如皋人，副教授，博士，研究方向為牧草病害及防治。E-mail:lindali1118@sina.com

中圖分類號：S435.4

文獻標志碼：A

文章編號：1001-0629(2016)6-1183-06*

Corresponding author:Li Ke-meiE-mail:lindali1118@sina.com

張芯偽，穆乃外爾·阿卜杜克熱木，朱里里，李克梅.新疆紫花苜蓿叢枝病分子檢測及鑒定.草業(yè)科學,2016,33(6)：1183-1188.

Zhang X W,Munewell·Abdukrem,Zhu L L,Li K M.Molecular detection and identification of lucerne witches broom disease in Xinjiang.Pratacultural Science，2016,33(6)：1183-1188.

第一作者：張芯偽(1990-)，男，山東梁山人，在讀碩士生，研究方向為牧草病害及防治。E-mail：564042240@qq.com