王慶華，王生存，李　斌，劉　春，吳劉成，王　旭，邵義祥*

(1.南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001； 2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇南通 226001)

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蛋白磷酸酶2A催化亞基α在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞遷移中的作用研究

王慶華1，王生存1，李斌2，劉春1，吳劉成1，王旭1，邵義祥1*

(1.南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇南通 226001； 2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇南通 226001)

摘要：利用體外基因敲除技術(shù)檢測(cè)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)周期和遷移能力的變化，探究蛋白磷酸酶2A的Cα亞基在MEFs細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用。用Cαfl/fl的純合子雄鼠與雌鼠1∶2配對(duì)，取E12.5 d的胚胎制作小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。利用表達(dá)Cre重組酶(Ad-Cre-EGFP)以及GFP熒光蛋白(Ad-EGFP)的腺病毒載體，對(duì)P3代MEFs進(jìn)行感染，分別用PCR，RT-PCR和Western blot方法進(jìn)行基因型鑒定。同時(shí)利用流式分選技術(shù)檢測(cè)感染后MEFs的細(xì)胞周期的變化，利用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)了其細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示，胰酶消化的方法成功獲得了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，DNA，RNA和蛋白水平的鑒定獲得了3對(duì)3的野生型和基因敲除MEFs。流式分選發(fā)現(xiàn)Ad-Cre處理的MEFs與Ad-EGFP處理的MEFs相比，處于G2期的細(xì)胞比例為30.8%±2.57%，高于Ad-EGFP MEFs的23.9%±2.46%，并且細(xì)胞碎片的比例也遠(yuǎn)高于后者。劃痕試驗(yàn)表明，Cα亞基缺失后細(xì)胞遷移能力下降，12 h就顯著低于對(duì)照組。結(jié)果表明，腺病毒攜帶的Cre重組酶能夠在體外有效地敲除掉MEFs中的蛋白磷酸酶2A的Cα亞基，PP2A Cα亞基的缺失會(huì)導(dǎo)致MEFs細(xì)胞周期傾向于阻滯在G2期，并會(huì)降低細(xì)胞遷移的能力。

關(guān)鍵詞：蛋白磷酸酶2A；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；細(xì)胞遷移；細(xì)胞周期

細(xì)胞遷移在多個(gè)生命過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，例如胚胎發(fā)育、血管生成、神經(jīng)生長(zhǎng)、組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥以及侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。有很多信號(hào)通路參與其中的調(diào)節(jié)過(guò)程，磷酸化作為一個(gè)快速發(fā)生并且可逆的蛋白翻譯后修飾的過(guò)程是其中重要的機(jī)制之一[1]。在T淋巴細(xì)胞中，蛋白磷酸酶I和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)能夠與cofilin結(jié)合并使之去磷酸化從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移過(guò)程[2]。PP2A通過(guò)B′亞基定位到細(xì)胞黏著點(diǎn)并與paxillin結(jié)合使之酪氨酸基團(tuán)去磷酸化促進(jìn)細(xì)胞遷移[3-4]。

PP2A是30多個(gè)絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一，其結(jié)構(gòu)亞基A和催化亞基C各具有α和β異構(gòu)體，其具有4種不同的調(diào)節(jié)亞基家族，可以組成100多種不同的全酶，能使眾多底物去磷酸化，從而影響細(xì)胞的遷移、分化和凋亡[5]。其中Cα的表達(dá)量為Cβ的10倍。PP2A蛋白表達(dá)量高，在有的細(xì)胞中能達(dá)到總蛋白的1%[6]。PP2A的催化活性受到許多因素的調(diào)節(jié)，如調(diào)節(jié)亞基、翻譯后修飾、抑制性蛋白質(zhì)、第二信使和酶抑制劑等[7-8]。在Ahnak 敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)中，PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate )刺激PKC-α和Raf的磷酸化程度上升的能力降低，主要是因?yàn)镻P2A在Ahnak缺失的條件下對(duì)PKC-α和Raf的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)其脫磷酸化[9]。PP2A-B55α和Cdc14B在MEFs中相互作用，進(jìn)而影響DNA雙鏈斷裂后的修復(fù)過(guò)程[9]。PP2A能夠與Pin1和AMPK互作，進(jìn)而影響MEFs細(xì)胞周期[10]。本研究通過(guò)腺病毒載體表達(dá)的Cre重組酶在體外敲除MEFs的PP2A Cα亞基，通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測(cè)了其細(xì)胞周期以及細(xì)胞遷移能力的改變，探討了Cα亞基在細(xì)胞遷移過(guò)程的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑DAPI(D9542)，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)定量熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒，南京諾維贊公司產(chǎn)品；Trizol，TaKaRa公司產(chǎn)品；PI(Propidium iodide)染色液，Sigma公司產(chǎn)品；Western blot抗體PP2A-C(#80665)，Santa Cruz 公司產(chǎn)品；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PP2A Cα敲除鼠和同窩野生型對(duì)照鼠均來(lái)自于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，品系為C57BL/6J，共12只，其中雄鼠4只，雌鼠8只，10周齡，飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境中，自由采食，明暗周期為12 h/12 h。使用許可證號(hào)為SYXK(蘇)2012-0031。

1.1.3腺病毒表達(dá)Cre重組酶(Ad-Cre-EGFP)以及GFP熒光蛋白(Ad-EGFP)的腺病毒載體由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所饋贈(zèng)，利用293A細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增純化后備用。

1.2方法

1.2.1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離及腺病毒感染用Cαfl/fl的純合子雄鼠與雌鼠(來(lái)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)以1∶2比例配對(duì)，配2籠，每天8：00之前檢查小鼠陰道栓，見栓當(dāng)天胚齡記為0.5 d(0.5 days postcoitum，0.5 dpc)。取11.5 dpc胚胎，尾巴留作基因型鑒定用，去除頭、內(nèi)臟及四肢，剪碎后2.5 g/L的胰酶在37℃水浴中振蕩消化20 min，3 000 r/min離心3 min，去上清后10% FBS的DMEM(高糖)重懸，均勻接種到6 cm培養(yǎng)皿中，次日換液。根據(jù)基因型鑒定結(jié)果留3對(duì)3野生型和敲除鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為試驗(yàn)用，標(biāo)記為P1代。本研究使用P3代細(xì)胞作為研究對(duì)象。用病毒數(shù)和細(xì)胞數(shù)1∶1的比例感染MEFs，每個(gè)10 cm培養(yǎng)中加入3 mL的5% FBS-DMEM，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后加入7 mL的全培養(yǎng)基繼續(xù)感染過(guò)夜，次日換液并復(fù)染DAPI后進(jìn)行檢測(cè)GFP熒光，如果感染率較低則再次感染。

1.2.2流式細(xì)胞儀分選檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡取P3代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，胰酶消化后收集，計(jì)數(shù)，以1×106cells/100 μL的量加入FACS分選管。加1 mL PBS清洗細(xì)胞，500 r/min離心5 min，去上清。重復(fù)洗一次后用100 μL流式細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL PI染色液，混勻，冰上或者室溫避光孵育10 min～15 min。上機(jī)進(jìn)行流式分析。

1.2.3細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力先用Marker筆在6孔板背后均勻地劃?rùn)M線，每隔0.5 cm～1 cm一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線。每孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞。第2天用槍頭沿著直尺劃痕。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按0、6、12、24 h取樣，拍照后用Imag J軟件進(jìn)行分析。

1.2.4基因型鑒定及基因表達(dá)檢測(cè)用PCR和RT-PCR法進(jìn)行基因型鑒定。常規(guī)酚氯仿法抽提小鼠胚胎成纖維細(xì)胞DNA，使用25 μL體系用引物P2 F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，59℃退火，35個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用Trizol抽取胚胎成纖維細(xì)胞RNA，去除基因組DNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板用引物EXdel F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，58℃退火，20個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。熒光定量PCR檢測(cè)以cDNA為模板用SYBR Premix EXTaq體系進(jìn)行擴(kuò)增，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物為P4 F/R(表1)。 收集細(xì)胞后用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定濃度后加入上樣緩沖液煮沸變性5 min，80 g/L的SDS-PAGE膠電泳分離，100V電泳90 min，濕法轉(zhuǎn)膜80 min后，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃過(guò)夜。TBST洗滌5 min，3次，二抗室溫孵育1 h后ECL顯影。

表1　引物序列

2結(jié)果

2.1MEFs制作和基因型鑒定

利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)Cre-EGFP(Ad-Cre)的試驗(yàn)組病毒以及僅表達(dá)EGFP(Ad-EGFP)的對(duì)照病毒，用293A細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增后超速離心純化，分裝凍存于-80℃?zhèn)溆?。用?lái)自E12.5的小鼠胚胎制作成小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，記為P1代。取P3代MEFs進(jìn)行病毒感染，檢測(cè)GFP熒光表達(dá)判斷感染效率(圖1)，并取感染后細(xì)胞提取DNA，RNA和蛋白進(jìn)行基因型鑒定。以DNA為模版，用引物P2 F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增分別檢測(cè)5′端的LoxP位點(diǎn)，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在5′端會(huì)檢測(cè)到593 bp的LoxP條帶和369 bp的野生型條帶(圖2A上)。用引物Exdel F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)基因敲除后殘余片段，產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，敲除鼠MEFs獲得了339 bp條帶，而野生型鼠MEFs則沒(méi)有條帶(圖2A下)。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，作為模版用P4 F/R引物檢測(cè)外顯子缺失情況，電泳檢測(cè)會(huì)觀察到451 bp的剪切后條帶和877 bp的野生型條帶(圖2B)。在此基礎(chǔ)上，Western blot檢測(cè)MEFs細(xì)胞中PP2AC的表達(dá)，純合子中PP2AC蛋白表達(dá)量顯著降低，并沒(méi)有完全消失，這是由于C亞基的高度同源性導(dǎo)致抗體不能完全區(qū)分這兩個(gè)亞基(圖2C和圖2D)。

圖1　腺病毒感染效率免疫熒光觀察結(jié)果(10×)

A． 以DNA為模板，用P2 F/R引物檢測(cè)5′端LoxP位點(diǎn)，用Exdel F/R引物檢測(cè)敲除后殘余片段；B． 以cDNA為模板，用P4 F/R引物通過(guò)RT-PCR檢測(cè)敲除效率；C． 提取感染后MEFs細(xì)胞蛋白，用Western blot檢測(cè)PP2AC的表達(dá)；D． Western blot結(jié)果的灰度分析統(tǒng)計(jì)。其中1表示Cαfl/fl:Ad-Cre，2表示Cαfl/+:Ad-Cre，3表示Cαfl/+:Ad-EGFP，4表示Cαfl/fl:Ad-EGFP。

A． PCR amplification of 5′ LoxP site with primers P2 F/R,and of residue fragment after deletion by Cre recombinase with primers Exdel F/R； B． RT-PCR investigation on knockout efficiency with primers P4 F/R using cDNA as template；C． Western blot analysis on the protein expression of PP2AC in knockout MEFs and the control；D． Density analysis on the Western blot bands.1 indicates Cαfl/fl:Ad-Cre,2 indicates Cαfl/+:Ad-Cre,3 indicates Cαfl/+:Ad-EGFP,4 indicates Cαfl/fl:Ad-EGFP

圖2腺病毒感染后MEFs細(xì)胞敲除效率檢測(cè)

Fig.2Examination of knockout efficiency in MEFs after adenovirus infection

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

用流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，用PI染色后流式分選，發(fā)現(xiàn)PP2A Cα缺失的MEFs細(xì)胞碎片所占的比例高于野生型細(xì)胞，說(shuō)明其中細(xì)胞凋亡較高。對(duì)流式分選結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)PP2A Cα敲除MEFs(Cafl/fl:Ad-Cre)中處于G2期的細(xì)胞比例為30.8%±2.57%，而野生型MEFs(Cafl/fl：Ad-EGFP)中處于G2期的細(xì)胞比例為23.9%±2.46%，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)二者之間差異并不顯著(圖3A，B)。

2.3細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)

目前也有很多研究表明PP2A通過(guò)去磷酸化作用參與了細(xì)胞遷移的過(guò)程。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)是一種常見的研究細(xì)胞遷移的試驗(yàn)方法，簡(jiǎn)單易行，可重復(fù)性較高。因此本研究用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)缺失催化亞基Cα的情況下MEFs遷移能力的變化。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在劃痕后0 h，6 h二者并沒(méi)有顯著性差異。但在12 h時(shí)二者差異顯著，敲除后MEFs遷移能力顯著低于野生型MEFs。在24 h二者的差異更顯著(圖4)。

圖3　腺病毒感染后細(xì)胞凋亡檢測(cè)

A． 感染后MEFs劃痕試驗(yàn)光鏡檢測(cè)(×10)；B． 劃痕后特定時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞傷痕剩余距離統(tǒng)計(jì)結(jié)果

A.Scratch test on MEFs infected with Ad-Cre-EGFP and Ad-EGFP (×10)；B.Statistics on the distance of MEFs infected with Ad-Cre-EGFP and Ad-EGFP

圖4腺病毒感染后MEFs劃痕試驗(yàn)結(jié)果

Fig.4Scratch test on MEFs after adenovirus infection

3討論

PP2A是一個(gè)廣泛性表達(dá)的蛋白，主要參與蛋白脫磷酸化過(guò)程，從而調(diào)控機(jī)體的各種生命活動(dòng)，包括細(xì)胞周期和凋亡過(guò)程。細(xì)胞周期(cell cycle)是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂所經(jīng)歷的所有過(guò)程，包括間期(interphase)和有絲分裂期(M phase)。間期以DNA合成為標(biāo)志，由G0期、間期、G1期和S期構(gòu)成，而M期則完成了細(xì)胞的分裂，從而形成新的細(xì)胞。這過(guò)程受到內(nèi)源性“Cyclins-CDKs-CKIs”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，從而完成器官和組織的發(fā)育。其中Cyclins為正向調(diào)控CDKs的關(guān)鍵因子，而研究表明PP2A(Cdc55/B55)能夠調(diào)節(jié)Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平[11]。在T淋巴細(xì)胞中，蛋白磷酸酶I和蛋白磷酸酶2A能夠和cofilin結(jié)合并使之去磷酸化從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移過(guò)程[2]。PP2A通過(guò)B′亞基定位到細(xì)胞黏著點(diǎn)并與paxillin結(jié)合使之絡(luò)氨酸基團(tuán)去磷酸化促進(jìn)細(xì)胞遷移[3-4]。在MEFs細(xì)胞中，PP2A也參與多條信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而影響MEFs細(xì)胞DNA修復(fù)，周期變化以及遷移[9-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用12.5 d的小鼠胚胎通過(guò)胰酶消化的方法成功獲得胚胎成纖維細(xì)胞，利用腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建和擴(kuò)增了表Cre重組酶和EGFP熒光蛋白的對(duì)照腺病毒。通過(guò)體外用腺病毒感染MEFs的方法成功建立了PP2A Cα敲除的MEFs細(xì)胞，并直接通過(guò)觀察熒光的表達(dá)來(lái)判斷感染效率。通過(guò)PCR方法鑒定出ppp2ca敲除的MEFs，從而在DNA水平上確認(rèn)了Cα基因已經(jīng)被敲除。接著以cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)鑒定出Cα基因在RNA水平上也成功被敲除掉了[12]。最后利用Western blot技術(shù)在蛋白水平上驗(yàn)證了Cα基因的敲除狀況?？梢钥闯黾兒献覯EFs中PP2A的表達(dá)量顯著低于野生型，但并沒(méi)有完全剔除干凈。這是由于Cα和Cβ基因僅在N端有3個(gè)氨基酸序列的差異，沒(méi)有特異性的抗體進(jìn)行識(shí)別，而前者表達(dá)量是后者的10倍[13-14]，Cβ基因的冗余效應(yīng)導(dǎo)致蛋白表達(dá)量檢測(cè)不能達(dá)到100%的敲除效率，但整體表達(dá)量的顯著下降也表明敲除是有效的。

本研究PI染色后流式分選結(jié)果顯示，敲除MEFs中處于G2期的比例為30.8%±2.57%，高于野生型MEFs中的23.9%±2.46%，說(shuō)明敲除Cα后細(xì)胞會(huì)傾向于阻滯在G2期，降低其增殖效率，但統(tǒng)計(jì)分析并沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。我們?cè)谠囼?yàn)過(guò)程中也觀測(cè)到敲除的MEFs中細(xì)胞碎片的比例也高于野生型MEFs，這也部分驗(yàn)證了敲除Cα可能會(huì)增加MEFs凋亡。由于在FACs分選時(shí)凋亡細(xì)胞被洗掉，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期并沒(méi)有差異。

本研究細(xì)胞劃痕試驗(yàn)表明，缺失Cα基因?qū)е录?xì)胞遷移能力在12 h后顯著降低(圖4B)。在圖4A中可以觀察到敲除組MEFs雖然劃痕也在緩慢愈合，但愈合速度顯著低于對(duì)照組細(xì)胞，表明其遷移能力降低，與目前已發(fā)表的研究結(jié)論相吻合，PP2A功能的缺失導(dǎo)致了cofilin和paxillin不能正常去磷酸化而活性降低，從而不能正常地繼續(xù)細(xì)胞的遷移活動(dòng)[2]。

綜上所述，PP2A的Cα基因在調(diào)節(jié)MEFs細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移過(guò)程中具有重要的作用。本研究的結(jié)果顯示，Cα基因的缺失能夠輕微影響小鼠胚胎成纖維細(xì)胞周期，而顯著降低其遷移的能力。對(duì)于其具體作用于何種下游底物以及具體的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

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Effects of Catalytic Subunit α of Protein Phosphatase 2A on Cell Migration of Mouse Embryo Fibroblasts

WANG Qing-hua1,WANG Sheng-cun1,LI Bin2,LIU Chun1,WU Liu-cheng1,WANG Xu1,SHAO Yi-xiang1

(1.LaboratoryAnimalCenterofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China;2.DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China)

Abstract:To investigate the effects of catalytic subunit α of protein phosphatase 2A (PP2A) on cell cycle and cell migration in mouse embryo fibroblasts(MEFs), the mouse embryos were got at E12.5 by mating the heterozygotes of Cα subunit conditional knockout male and female homozygous mice at the ratio of 1∶2.MEFs were prepared by trypsin digestion and genotyped by PCR,RT-PCR and Western blot to identify the genetic basis of each embryo.Adenovirus associated Cre recombinase and GFP immunofluorescence protein were constructed and delivered to the P3 MEFs to knockout the Cα gene,GFP was used as control.After confirming the knockout efficiency by PCR,RT-PCR and Western blot,FACs was carried out to determine the cell cycle.Cell scratch test was carried in MEFs treated with the two kinds of viruses to investigate the effects on migration.Adenovirus associated Cre recombinase could knockout the gene efficientlyinvitro.The knockout MEFs at G2 stage was 30.8%±2.57%,while the control MEFs was 23.9%±2.46%,and had more cell debris.Loss of Cα decreased the cell migration ability significantly from 12h after the scratch.Cre recombinase delivered by adenovirus could efficiently pop out double floxed geneinvitro.Disruption of Cα subunit slightly arrested the MEFs at G2 stage,and decreased the migration ability.

Key words:protein phosphatase 2A; mouse embryonic fibroblast; cell migration; cell cycle

收稿日期：2015-10-29

基金項(xiàng)目：江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(11KJB180010)；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(14KJB180018)；江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(15KJB180015)

作者簡(jiǎn)介：王慶華(1978-)，男，江蘇泰州人，碩士研究生，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號(hào):S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0049-06