徐　晶，陳立志，劉曉穎，馮二凱

(1. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生化教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 吉林省部共建特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，吉林長春 130112)

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壞死梭桿菌外膜蛋白提取及免疫原性分析

徐晶1，陳立志2*，劉曉穎2，馮二凱2

(1. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生化教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 吉林省部共建特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，吉林長春 130112)

摘要：從壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum，F(xiàn)N)中提取外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)并分析免疫原性。采用無菌心腦浸液(BHI)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)壞死梭桿菌,用20 mmol/L HEPEs-LiCl緩沖液提取外膜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE、Western blot和接種小鼠病理學(xué)檢測分析表明，具有唯一條帶，分子質(zhì)量為44.5 ku，具有良好的免疫活性并有一定毒性，研究結(jié)果為壞死梭桿菌亞單位疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：壞死梭桿菌；外膜蛋白；提取；免疫活性

壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum，F(xiàn)N)是引起動物肝膿腫、腐蹄病[1]、壞死性喉炎的主要病原菌，也是寄生在腸道、黏膜及口腔的重要人畜共患病原菌。壞死梭桿菌常引起人類咽炎、頸淋巴結(jié)腫大、頸內(nèi)靜脈的單側(cè)血栓性靜脈炎、急性扁桃體炎和扁桃體周圍囊腫[2-5]，甚至感染人的頭部和頸部[6]，嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量。研究壞死梭桿菌的毒力因子，是控制和預(yù)防壞死桿菌病發(fā)生與發(fā)展的重點(diǎn)。近年來，多種病原菌的外膜蛋白(OMP)已成為研究的熱點(diǎn)問題[7-11]，OMP具有較好的免疫活性，本研究提取壞死梭桿菌主要外膜蛋白，為壞死梭桿菌亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑心腦浸液(brain Heart Infusion，BHI)為BD Difco公司產(chǎn)品；維生素C(Vc)為Scientific Research Special公司產(chǎn)品；十二烷基肌氨酸鈉(SLS)和十二烷基硫酸鋰(LDS)為上海一基生物科技有限公司產(chǎn)品；HEPEs為北京華美生物工程有限公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)R-250為Sigma公司產(chǎn)品；Goat-anti-Rabbit IgG (H&L)、DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品；蘇木精-伊紅紫色液、蘇木精染色液和伊紅染色液為廈門邁威生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2菌種壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum, FN)AB型菌株，為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所分離鑒定及保存的毒力菌株。

1.2方法

1.2.1菌種復(fù)蘇將凍存的壞死梭桿菌(AB)，冷水浴解凍，取2 mL～3 mL接種于10 mL新鮮無菌BHI液體培養(yǎng)基中，將試管放入置于37℃恒溫培養(yǎng)箱的厭氧罐中約48 h恢復(fù)菌株活力，再接種到新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，重復(fù)此操作1～2次；選擇生長良好的菌液按1∶30～1∶50的比例傳到400 mL BHI液體培養(yǎng)基(用液體石蠟封面)中，用封口膜封好瓶口置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 OMP提取離心收集菌沉淀(4℃，6 000 r/min，20 min)，用0.8 g/L的生理鹽水清洗3次；每200 mL培養(yǎng)基細(xì)菌沉淀用10 mL PBS(pH 7.4)重懸，520 W冰上超聲波破碎(破碎時間6 s，間歇時間6 s，約200次)；輕微離心(4℃，1 000 r/min，30 min)去除沉淀中的細(xì)胞壁及未破碎細(xì)胞，獲取上清；4℃、15 000 r/min 30 min，棄上清，獲取沉淀；將沉淀用20 mL 5 g/L的SLS重懸沉淀，25℃，孵育30 min，除去細(xì)胞內(nèi)膜蛋白；4℃、15 000 r/min離心30 min，棄上清，獲取沉淀；將沉淀用20 mL 20 g/L LDS的20 mmol/L HEPEs-LiCl重懸，用NaOH微調(diào)pH為7.4，4℃孵育10 min；4℃、15 000 r/min 離心3 h，棄上清，獲取沉淀；將沉淀用5 mL 20 mmol/L HEPEs重懸；分裝100 μL，置-80℃保存。

1.2.3OMP含量測定將上述制備的蛋白樣品用20 mmol/L HEPEs緩沖液稀釋20倍，HEPEs做空白對照，將空白組和待測組加入到石英比色皿中，調(diào)零后分別讀取OD280 nm和OD260 nm的值，按照如下公式計算蛋白濃度。

蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=(1.45×OD280-0.74×OD260)× 稀釋倍數(shù)

1.2.4Western blot鑒定SDS-PAGE電泳，采用半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC)上，50 g/L脫脂奶粉的TBS/T 4℃封閉過夜。一抗為兔抗F.necrophrum(AB)血清(1：50)，二抗為山羊抗Goat-anti-rabbit IgG (1∶4 000)，DAB顯色檢測。

1.2.5小鼠病理學(xué)檢測分別取小鼠腹腔內(nèi)接種HEPEs(對照組)和壞死梭桿菌OMP(試驗組)的肝臟，冷凍切片，進(jìn)行病理組織學(xué)檢測，按以下操作進(jìn)行。

①前處理。將冷凍切片機(jī)預(yù)冷至-20℃，新的載玻片和蓋玻片用750 mL/L乙醇浸泡過夜，待干燥后備用。②切片。從-80℃取出待檢測樣品置于冷凍頭上，固定液將其固定，設(shè)置厚度為10 μm，調(diào)整好切片角度，連續(xù)切取至載玻片上，做好記錄。③固定。Carnoy固定液固定0.5 min。④蘇木精染色。將片子置于蘇木精中染色8 min，隨后用蒸餾水沖洗3次。⑤分化。將片子置于10 mL/L鹽酸乙醇中進(jìn)行分化，4 min。⑥返藍(lán)。10 mL/L氨水返藍(lán)1 min。⑦伊紅染色。置于伊紅染色液中1 min。⑧梯度酒精脫色。將片子分別置于800 mL/L、950 mL/L、無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ，30 s、30 s、3 min和3 min。⑨二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，分別處理3 min。

2結(jié)果

2.1菌種的復(fù)蘇

接種壞死梭桿菌的BHI培養(yǎng)基混濁，乳白色，帶有微弱的臭味。革蘭染色檢測結(jié)果顯示壞死梭桿菌為革蘭陰性菌，呈短桿狀或球桿狀(圖1)。

2.2SDS-PAGE鑒定

SDS-PAGE鑒定,壞死梭桿菌OMP分子質(zhì)量大小為44.5 ku，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，大約在44.5 ku出現(xiàn)一條清晰可見的條帶(圖2)。

2.3Western blot分析

Western blot分析，在44.5 ku處出現(xiàn)條帶，表明該提取物具有反應(yīng)原性(圖3)。

2.4OMP含量

OMP粗提物經(jīng)20 mmol/L HEPEs 20倍稀釋，分光度計讀取OD260 nm和OD280 nm值(表1)。經(jīng)計算,蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=(1.45×OD280-

0.74×OD260)×稀釋倍數(shù)，計算結(jié)果OMP粗提的平均值是4.524 mg/mL。

2.5肝臟病理組織學(xué)檢測

病理切片在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)空白組組織無異常表現(xiàn)(圖4)。粗提取的OMP組肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死點(diǎn)(圖5)。

圖1壞死梭桿菌的革蘭染色(100×)

Fig.1Gram staining ofF.necrophorum(100×)

M. 蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.OMP粗提物

M.Protein molecular weight Marker; 1.Crude extract of OMP

圖2OMP的SDS-PAGE鑒定

Fig.2Identification of OMP by SDS-PAGE

1.OMP粗提物；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1.Crude extract of OMP; M.Protein molecular weight Marker

圖3OMP的Western blot分析

Fig.3Analysis of OMP by Western blot

表1　不同組OMP粗提物的OD260 nm和OD280 nm檢測結(jié)果

圖4小鼠病理切片檢測對照組

Fig.4Histopathological section of mouse in control group

圖5小鼠病理切片檢測試驗組

Fig.5Histopathological section of mouse in experimental group

3討論

近年來，壞死梭桿菌引起的壞死桿菌病給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，免疫接種疫苗是預(yù)防壞死梭桿菌感染的主要措施，疫苗的有效成分將成為我們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，外膜蛋白在免疫方面的作用備受關(guān)注，OMP是存在于細(xì)胞外膜間及其有關(guān)的蛋白質(zhì)[12]，直接與外界接觸。Shen J等[13]發(fā)現(xiàn)編碼外膜蛋白OprD2基因突變或片段缺失，導(dǎo)致外膜蛋白OprD2缺失，將使銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥；Kumar A等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)壞死梭桿菌42.5 ku OMP介導(dǎo)該細(xì)菌高親的粘附在牛內(nèi)皮細(xì)胞，引起牛肝臟膿腫性病變；Sun D等[16]研究證實壞死梭桿菌外膜蛋白與其他細(xì)菌外膜蛋白序列相似，系統(tǒng)發(fā)育分析表明壞死梭桿菌的發(fā)病與其遺傳進(jìn)化有關(guān)。本試驗粗提OMP具有免疫原性，因為單一的抗原可能不足以產(chǎn)生抵抗強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力，粗提OMP將有望成為預(yù)防壞死桿菌病疫苗的候選成分。

本試驗從全菌中粗提取OMP分析分子質(zhì)量，為進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)組成和分析OMP免疫功能提供條件。OMP經(jīng)Western blot證實具有免疫活性，將為開發(fā)OMP亞單位疫苗提供理論基礎(chǔ)，也為壞死桿菌病的診斷提供特異性抗原。

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Extraction of Outer Membrane Proteins fromFusobacteriumnecrophorumand Analysis of Its Immunogenicity

XU Jing1, CHEN Li-zhi2, LIU Xiao-ying2, FENG Er-kai2

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar，Heinongjiang,161006,China;2.StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialEconomicalAnimals,InstituteofSpecialAnimalandPlantScience,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Changchun,Jilin,130112,China)

Abstract:In this study, we obtained outer membrane protein (OMP) fromFusobacteriumnecrophorum(FN) and analyzed its immunogenicity.Fusobacteriumnecrophorum(FN) was cultured with sterile brain heart infusion (BHI). The outer membrane protein (OMP) was extracted with 20 mmol/L HEPEs-LiCl buffer. The results showed that we successfully obtained the crude extract of OMP by analysis of SDS-PAGE. Western blot confirmed the immune activity of the OMP. The pathologic examination of mice showed that the OMP was toxic. This study provided basic data for development of FN subunit vaccine.

Key words:Fusobacteriumnecrophorum; outer membrane protein; extraction; immune activity

收稿日期：2015-11-30

基金項目：吉林省科技發(fā)展計劃項目(20110223)

作者簡介：徐晶(1986-)，女，黑龍江省肇東人，碩士研究生，主要從事分子細(xì)菌學(xué)研究。 *通訊作者

中圖分類號:S852.616.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0026-04