姜蓬壘 張 棟 李美寧 常冰梅（山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001）

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HGF-cMet拮抗劑NK4增強肝癌細胞Li-7對5-FU的敏感性

姜蓬壘 張 棟 李美寧 常冰梅*
（山西醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，山西 太原 030001）

【摘要】目的 探索肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）對肝癌細胞Li-7增殖及對化療藥物5-FU耐受的影響；研究利用HGF拮抗劑-NK4增強Li-7細胞在HGF存在的情況下對5-FU的敏感性的影響。方法 將前期構建的真核細胞表達質(zhì)粒pcDNA3.1-NK4、pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至Li-7細胞中。MTT法檢測不同濃度（0、0.2、2、20 ng/mL）HGF對Li-7細胞增殖的影響；確證HGF是否會誘導Li-7對5-FU產(chǎn)生耐受；檢測在HGF、5-FU的干預下，未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NK4組的Li-7細胞生存率的差異。結果 在HGF的刺激下，Li-7的存活率沒有明顯變化（P＞0.05）。但HGF（20 ng/mL）、5-FU（50 μg/mL）共同處理與5-FU單獨處理相比，細胞存活率明顯提升（P＜0.01）。在HGF（20 ng/mL）與不同濃度的5-FU（0、5、50、500 μg/mL）的干預下，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NK4組與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組的Li-7細胞相比細胞生存率都明顯降低（P＜0.05）。結論 HGF可以誘導Li-7產(chǎn)生耐藥性，而NK4能夠減弱HGF 對Li-7細胞的刺激，增強5-FU對Li-7的增殖抑制作用。

【關鍵詞】肝細胞生長因子；NK4；5-FU；藥物耐受

HGF參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［1］。c-MET作為HGF的細胞膜表面受體，在HGF的作用下磷酸化激活，而后活化的c-MET再激活其下游多條關鍵的信號通路，產(chǎn)生促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移及抗凋亡的生物學效應［1-2］。NK4是包含了HGF N-末端的發(fā)卡結構域和后面的4個環(huán)狀結構域的HGF片段，它可以競爭性的抑制HGF對細胞的刺激［3］。HGF的過表達常導致腫瘤產(chǎn)生藥物耐受［1］，因此將NK4和化療藥物聯(lián)合起來抑制腫瘤生長似乎成為了一個較為理想的手段。本文首先探索HGF對Li-7增殖、耐藥的影響，然后再嘗試利用NK4增強Li-7細胞在HGF存在的情況下對5-FU的敏感性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株以及細胞株：pcDNA3.1-NK4質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、肝癌細胞株Li-7由本室構建或保存。

1.2 主要試劑：HGF購自PeproTech公司；5-FU；胰蛋白胨、瓊脂、酵母粉購自OXOID公司；NaCl購自天津市風船化學試劑科技有限公司；PBS購自北京索萊寶科技有限公司；Endo Free Plasmid Mini KitⅠ購自OMEGA公司；1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司；氨芐青霉素、青霉素鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶購自AMERSCO公司；DMSO、MTT購自AMERSCO公司；Lip2000、Annexin V-FITC/PI雙染流式檢測試劑盒購自Invitrogen公司。

1.3 質(zhì)粒提?。簩y帶有pCDNA3.1/NK4和pCDNA3.1質(zhì)粒的DH5α菌種接種于LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)12～16 h。按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的Li-7細胞接種在6孔板中，待匯合度達到50%～60%時棄去培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，加入預熱至37 ℃無血清、抗生素的1640完全培養(yǎng)液。按照Lip2000說明書進行轉(zhuǎn)染，6 h后更換為含10%FBS的1640完全培養(yǎng)液。24 h后進行后續(xù)實驗。

1.5 MTT法檢測細胞存活率：選取處于對數(shù)生長期或者轉(zhuǎn)染后的Li-7細胞，消化后制成單細胞懸液，按照1×104個/孔接種至96孔板中。24 h后更換為含有藥物、10%的胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2，飽和濕度的條件下培養(yǎng)48 h。每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h。小心吸取培養(yǎng)基，每孔加入150 μL的DMSO，在搖床上震蕩約20 min。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測各孔吸光值。每組5個平行孔，實驗重復3次。根據(jù)下面的公式計算各實驗組的存活率：存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）1.6 統(tǒng)計學分析：實驗結果均以表示，統(tǒng)計分析采用one way ANOVA。用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HGF對Li-7增殖的影響：見圖1。以不同濃度（0、0.2、2、20 ng/mL）的HGF刺激Li-7細胞48 h后，用MTT法檢測HGF對細胞增殖能力的影響。如圖1所示，各濃度的HGF對Li-7細胞的增殖能力影響不大，當HGF濃度為20 ng/mL時，細胞的存活率也只有104.9%±3.2%，與對照相比差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 HGF對Li-7增殖能力的影響

2.2 HGF誘導Li-7對5-FU產(chǎn)生耐受：見圖2。當HGF濃度為0.2 ng/mL或2 ng/mL時，HGF與5-FU（50 μg/mL）共同處理組的細胞存活率與單加5-FU組的細胞存活率相比，差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；當HGF濃度達到20 ng/mL時，共同處理組與單加5-FU組相比，細胞存活率提高了15.8%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。即此時Li-7表現(xiàn)出較高的藥物耐受。選擇20 ng/mL的HGF濃度進行后續(xù)實驗。

圖2 HGF誘導Li-7對5-FU產(chǎn)生耐受

2.3 NK4逆轉(zhuǎn)HGF導致的化療耐受：見圖3。不同濃度的5-FU處理后，轉(zhuǎn)染有NK4基因的細胞與轉(zhuǎn)染有空載質(zhì)粒的細胞相比，轉(zhuǎn)染有NK4基因的細胞的存活率均有不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 NK4抑制HGF誘導的藥物耐受

3 討 論

HGF對于多數(shù)類型的腫瘤細胞來說都具有促增殖、侵襲、遷移的作用，但是它對于很多肝癌細胞來說，它又具有了雙重作用：一方面，HGF促進了肝癌細胞HepG2、Huh7等細胞的運動性；另一方面，HGF又抑制了這些細胞的增殖［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，HGF對Li-7細胞的增殖無明顯影響。這表明多功能的細胞因子HGF對于不同的肝癌細胞株表現(xiàn)出不同的生物學效應。

HGF/c-MET信號通路具有促增殖、抗凋亡的作用，從而使細胞受到化療藥物的傷害減少，導致了耐藥性的產(chǎn)生［1］。已經(jīng)有大量的研究表明HGF能夠誘導多種類型的腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，但是目前僅有關于HGF可以引起肝癌細胞HEP3B產(chǎn)生耐藥性的報道［5］。通過細胞增殖實驗，我們發(fā)現(xiàn)低濃度的HGF并沒有影響Li-7細胞對5-FU的敏感性，但是將HGF的濃度提高到20 ng/mL之后，細胞的存活率明顯提高，這說明高濃度的HGF可以誘導Li-7耐藥性的產(chǎn)生。

在以前的研究中，NK4只是被用來抑制HGF誘導的肝癌細胞侵襲、遷移等［6］，因此在發(fā)現(xiàn)HGF可以誘導肝癌細胞Li-7耐藥之后，我們也嘗試利用NK4逆轉(zhuǎn)肝癌細胞耐藥。細胞增殖結果顯示，在HGF與5-FU的共同作用下，轉(zhuǎn)染有NK4基因的Li-7細胞存活率與轉(zhuǎn)染有空載質(zhì)粒的Li-7細胞存活率相比明顯降低。這說明NK4有效的減弱了HGF對細胞的保護作用，增強了Li-7對5-FU的敏感性。

本研究發(fā)現(xiàn)HGF可以誘導Li-7細胞產(chǎn)生對5-FU的耐藥性，而利用NK4可以減弱HGF對Li-7細胞促生存、抗凋亡的作用，逆轉(zhuǎn)耐藥性。這提示有望利用NK4基因針對肝癌患者進行基因靶向治療，為肝癌治療提供新策略和新方法。

參考文獻

［1］ Jiang WG，Martin TA，Parr C，et al.Hepatocyte growth factor，its receptor，and their potential value in cancer therapies［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2005，53（1）:35-69.

［2］ You H，Ding W，Dang H，et al.c-Met represents a potential therapeutic target for personalized treatment in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2011，54（3）:879-89.

［3］ Datea K，Shimurab H，Tanakab M，et al.HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions of hepatocyte growth factor［J］. FEBS Lett，1997，420（1）:1-6.

［4］ Giordano S，Columbano A.Met as a therapeutic target in HCC: facts and hopes［J］.J Hepatol，2014，60（2）:442-52.

［5］ Yu G，Jing Y，Kou X，et al.Hepatic stellate cells secreted hepatocyte growth factor contributes to the chemoresistance of hepatocellular carcinoma［J］.PloS One，2013，8（9）:e73312.

［6］ Heideman DA，Overmeer RM，van Beusechem VW，et al.Inhibition of angiogenesis and HGF-cMET-elicited malignant processes in human hepatocellular carcinoma cells using adenoviral vector-mediated NK4 gene therapy［J］.Cancer Gene Ther，2005，12（12）:954-962.

中圖分類號：R735.7

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）10-0043-02

*通訊作者：E-mail：cbmcn@163.com