何錦泉丁江峰歐陽(yáng)可雄黃 珞陳倫秋樸正國(guó)（ 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院?廣州口腔病研究所?口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 5040； 廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院口腔科，廣東 湛江 54000）

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BMP9 轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞聯(lián)合納米相羥基磷灰石聯(lián)合修復(fù)下頜骨

何錦泉1丁江峰2歐陽(yáng)可雄1黃 珞1陳倫秋1樸正國(guó)1
（1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院?廣州口腔病研究所?口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510140；2 廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院口腔科，廣東 湛江 524000）

【摘要】目的 評(píng)價(jià)應(yīng)用BMP-9基因修飾的ADSCs作為種子細(xì)胞，以納米羥基磷灰石作為載體，構(gòu)建組織工程化骨來(lái)修復(fù)大鼠下頜骨骨缺損的效果。方法 通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法把BMP9介導(dǎo)到大鼠脂肪干細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分布于納米羥基磷灰石上。用牙科裂鉆在下頜角區(qū)制備3 mm ×3 mm的骨缺損區(qū)，分別植入納米羥基磷灰石及BMP9-ADSCs。于術(shù)后3個(gè)月處死動(dòng)物，行microCT掃描及組織學(xué)檢查，評(píng)價(jià)骨缺損的修復(fù)情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組A見(jiàn)大量新生骨，可見(jiàn)成熟骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組B較多新生骨形成，骨細(xì)胞接近成熟。對(duì)照組骨缺損處基本被纖維組織充填，未見(jiàn)新骨生成。結(jié)論 納米羥基磷灰石與BMP9轉(zhuǎn)染的大鼠脂肪干細(xì)胞復(fù)合物植入下頜骨缺損中，可以促進(jìn)骨缺損修復(fù)，增加血管化與骨化。

【關(guān)鍵詞】BMP9；脂肪干細(xì)胞；納米羥基磷灰石；骨缺損

長(zhǎng)期以來(lái)，頜骨修復(fù)一直是口腔頜面外科領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。用羥基磷灰石衍生物作為組織工程載體的研究已取得初步結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腺病毒將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9（ human bone morphogenetic protein，hBMP-9）體外轉(zhuǎn)染大鼠脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cells，ADSCs），應(yīng)用BMP-9基因修飾的ADSCs作為種子細(xì)胞，以納米羥基磷灰石作為載體，構(gòu)建組織工程化骨來(lái)修復(fù)大鼠下頜骨骨缺損。

1 材料與方法

1.1 重組BMP9腺病毒的構(gòu)建、鑒定：采用Adeno-XTM 試劑盒構(gòu)建重組攜帶BMP9基因的腺病毒，通過(guò)脂質(zhì)體載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得攜帶BMP9基因的腺病毒液，再通過(guò)293細(xì)胞大量擴(kuò)增攜帶BMP9的腺病毒液，光比色法測(cè)定滴度，超離純化后，濃縮得到1010～1011 pfu/uL的BMP9腺病毒液。

1.2 大鼠脂肪干細(xì)胞的獲取及基因轉(zhuǎn)染：選取SD大鼠10只，從雙側(cè)腹股溝內(nèi)獲取脂肪組織，用剪刀剪碎后加入I型膠原酶（濃度1 mg/mL）消化，37 ℃在振蕩器上搖晃1 h，然后以1000 rpm離心5 min，獲得的細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS）制成均勻的細(xì)胞懸液，均勻接種于培養(yǎng)皿中，在CO2孵箱中培養(yǎng)，溫度為37 ℃，每3～4 d換液1次。采用第5代

ADSCs作為種子細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSCs相對(duì)特異細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD90及CD45，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入3 mL攜帶hBMP-9 基因的重組腺病毒液，37 ℃過(guò)夜，獲得BMP9轉(zhuǎn)染的ADSC，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 BMP9-ADSC與納米羥基磷灰石的復(fù)合：收獲BMP9-ADSC制備細(xì)胞懸液，采用反復(fù)滴加的方法，使細(xì)胞均勻分布于納米羥基磷灰石上。

1.4 模型建立：大鼠下頜骨缺損模型制備：對(duì)12只SD大鼠用10%水合氯醛行全身麻醉，在右側(cè)下頜骨下緣近下頜角處作約1 cm的切口，分離暴露下頜骨，在下頜角區(qū)用牙科裂鉆制備3 mm×3 mm的骨缺損區(qū)，造模后即刻在缺損區(qū)植入納米羥基磷灰石材料（實(shí)驗(yàn)組A）或者脂肪干細(xì)胞與納米羥基磷灰石的復(fù)合材料（實(shí)驗(yàn)組B），左側(cè)缺損區(qū)作為對(duì)照組，僅制備骨缺損區(qū)，未植入任何材料。

1.5 標(biāo)本處理及檢測(cè)指標(biāo)：于術(shù)后3個(gè)月處死動(dòng)物，行microCT掃描，根據(jù)三維重建的結(jié)果來(lái)評(píng)價(jià)骨缺損的修復(fù)情況。然后標(biāo)本置于10%的福爾馬林溶液，固定24 h后，用20%甲酸溶液中進(jìn)行脫鈣，制成石蠟標(biāo)本，行蘇木精-伊紅染色。主要觀察指標(biāo)：大鼠體內(nèi)植入材料降解情況和組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果，對(duì)標(biāo)本行HE染色，觀察新生骨小梁的生長(zhǎng)與改建情況。

2 結(jié) 果

2.1 組織學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)組A見(jiàn)大量新生骨，可見(jiàn)成熟骨細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組B較多新生骨形成，骨細(xì)胞接近成熟。對(duì)照組骨缺損處基本被纖維組織充填，未見(jiàn)新骨生成（圖1）。

2.2 影像學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)組A材料與骨組織融合在一起，修復(fù)良好，塑型基本完成，原缺損空腔幾乎完全長(zhǎng)滿新生骨組織；實(shí)驗(yàn)組B缺損邊緣基本連續(xù)，材料與骨接觸緊密，有較多新生骨形成且密度較高，缺損邊界模糊；對(duì)照組缺損處密度明顯低于正常骨組織，邊界非常清晰，修復(fù)效果較差（圖2）。

圖1 各組骨缺損區(qū)組織學(xué)改變（蘇木精-伊紅染色，×100）

圖2 各組骨缺損區(qū)microCT三維重建影像

3 討 論

目前臨床上治療腫瘤引起的下頜骨是頜面外科常見(jiàn)的一個(gè)難題，用羥基磷灰石衍生物作為組織工程載體的研究已取得初步結(jié)果。謝紅軍等［1］將納米羥基磷灰石與骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后回植于兔股骨缺損區(qū)，結(jié)果證實(shí)納米羥基磷灰石對(duì)細(xì)胞具有黏附性，適合細(xì)胞爬行替代，降低同種異體骨的用量，減輕機(jī)體的免疫反應(yīng)，可以作為外源生長(zhǎng)因子的良好載體。譚羽瑩等［2］發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石的生物活性與其顆粒大小有關(guān)，顆粒越小，新生骨的拉伸強(qiáng)度、拉伸模量和扭轉(zhuǎn)模量就越高，抗疲勞性也相應(yīng)提高，因此納米羥基磷灰石將更有利于提高植入物力學(xué)性能，克服其抗折強(qiáng)度低、脆性大、不能承重的缺點(diǎn)。

在以往的研究中，骨組織工程的種子細(xì)胞基本來(lái)源于骨髓，但因其取材受到限制，給患者帶來(lái)極大痛苦而限制其臨床應(yīng)用［3］。與骨髓干細(xì)胞相比，ADSCs具有取材方便，來(lái)源充足的特點(diǎn)［4］。本研究結(jié)果顯示，BMP9-ADSC聯(lián)合納米羥基磷灰石組的骨缺損區(qū)的修復(fù)效果最明顯，原缺損區(qū)幾乎全部被新生骨組織充滿。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組比較表明，骨缺損周邊三個(gè)創(chuàng)面雖然觀察到修復(fù)表現(xiàn)，但骨缺損區(qū)主要被肉芽組織充填，說(shuō)明BMP9-ADSCs與支架材料間良好的黏附作用及ADSCs在支架材料上正常增殖、分化，發(fā)揮成骨活性的作用，表明加入BMP9-ADSCs的修復(fù)材料更有利于骨缺損的修復(fù)。賀金曉等［5］通過(guò)在兔身上構(gòu)建假體周圍骨缺損模型，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B3雙基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），與羥基磷灰石復(fù)合，然后植入白兔骨缺損內(nèi)，觀察其對(duì)假體-骨界面的影響。結(jié)果顯示骨結(jié)合強(qiáng)度及假體骨界面骨接觸率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，術(shù)后12周與8周比較，有顯著性差異。作者認(rèn)為，納米羥基磷灰石及其復(fù)合物能夠促進(jìn)骨的再生，加速骨修復(fù)的進(jìn)程，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

本研究結(jié)果顯示，納米羥基磷灰石與BMP9轉(zhuǎn)染的大鼠脂肪干細(xì)胞復(fù)合物植入下頜骨缺損中，可以促進(jìn)骨缺損修復(fù)，增加血管化與骨化，是骨組織工程中一種效果明顯，值得推廣的復(fù)合物。

參考文獻(xiàn)

［1］ 謝紅軍，王銀龍，周健，等.納米羥基磷灰石復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞修復(fù)兔股骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)，2008（3）:154-156.

［2］ 譚羽瑩，邵英，李玉新，等.改性納米羥基磷灰石/聚乳酸-聚羥乙酸復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔橈骨缺損［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16（21）:3843-3846.

［3］ 吳子征，李受珉，王澤，等.同種異體脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣支架修復(fù)兔橈骨大段骨缺損［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2015，42（3）:338-343.

［4］ 沈凌，王錫友，陳萍，等.同種異體脂肪干細(xì)胞復(fù)合納米級(jí)膠原基骨材料修復(fù)尺骨缺損［J］. 中國(guó)組織工程研究，2015，19（32）:5162-5166.

［5］ 賀金曉，王英振，夏長(zhǎng)所，等.雙基因轉(zhuǎn)染兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與膠原/羥基磷灰石復(fù)合修復(fù)骨缺損及對(duì)假體-骨界面整合的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（6）:128-132.

中圖分類號(hào)：R318.08

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）10-0042-02

基金項(xiàng)目：廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生資助項(xiàng)目（20141A011098）