彭　楊，程　燚，楊宇馨，李崇義，李夢俠，張詩珩，王　東

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042)

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PCR-CTPP在DNA堿基切除修復(fù)基因SNP分型中的應(yīng)用

彭楊，程燚，楊宇馨，李崇義，李夢俠，張詩珩，王東△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心，重慶 400042)

[摘要]目的分析兩對引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-CTPP)在堿基切除修復(fù)(BER)途徑基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型中的應(yīng)用，為發(fā)現(xiàn)新的SNP檢測方法提供實驗依據(jù)。方法采用PCR-CTPP擴增BER途徑關(guān)鍵蛋白OGG1、XRCC1及APE1 4個常見SNP位點OGG1 Ser326Cys、XRCC1 Arg399Gln、APE1 Asp148Glu及-141T/G(位于啟動子區(qū)域)的DNA片段，凝膠電泳顯像后判讀基因型，同時與DNA測序的方式比對各基因位點的準(zhǔn)確性。結(jié)果PCR-CTPP方法基因分型結(jié)果與DNA測序得到的基因分型結(jié)果完全一致。結(jié)論PCR-CTPP技術(shù)可靠、快速，其廣泛應(yīng)用能夠有助于基因SNP的分型研究。

[關(guān)鍵詞]多態(tài)性，單核苷酸；兩對引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；堿基切除修復(fù)途徑

DNA損傷可被體內(nèi)外一系列理化因素誘發(fā)，是影響細胞生理功能甚至存活的重要過程。精確的DNA修復(fù)過程對于維持細胞正常狀態(tài)及染色體穩(wěn)定性十分重要[1]。堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)通路是修復(fù)DNA損傷的重要途徑，其目的是移除和代替受損的核苷酸。這個過程通常由某種底物特異性的DNA糖基化酶啟動，糖基化酶可以識別和切除一些經(jīng)過特定修飾的堿基，所產(chǎn)生的脫嘌呤/脫嘧啶(AP)位點，則是被AP內(nèi)切酶，即脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinic/aprimidinic endonuclease,APE1，也稱為APEX1或Ref-1)剪切。隨后產(chǎn)生的AP位點由DNA連接酶修補[2]。參與BER途徑的關(guān)鍵蛋白主要有3種，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(8-Oxoguanine glycosylase，OGG1)，APE1和X線修復(fù)交叉互補基因 1(X-ray cross complementing group 1，XRCC1)。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是一種常見的基因變異，研究發(fā)現(xiàn)基因的SNP可能通過改變蛋白的結(jié)構(gòu)或活性從而參與眾多生物學(xué)過程。通過高通量測序、芯片等方式確定功能性SNP的基因型和氨基酸，對于明確其生物學(xué)功能，研究其與臨床問題間的相關(guān)性具有重要意義[3-4]。DNA修復(fù)途徑的SNPs被證實可能引起多種腫瘤發(fā)病風(fēng)險的改變[5-7]。在BER途徑的3種關(guān)鍵蛋白中，研究最多的SNP位點包括OGG1 Ser326Cys、APE1 Asp148Glu及XRCC1 Arg399Gln，這些變異位點都位于編碼區(qū)，可能導(dǎo)致蛋白序列的改變，而非編碼區(qū)，特別是啟動子區(qū)域的基因變異可能會導(dǎo)致基因表達的變化，從而產(chǎn)生后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)。因此，確定這些蛋白的基因分型可能具有重要意義。

常用的檢測SNP基因分型的方法包括高通量的SNP芯片和采用Taqman探針的PT-PCR，以及低通量的限制片段長度基因分型-PCR(PCR-restriction fragment length polymorphism genotyping,PCR-RFLP)。但目前而言，由于普通實驗室及臨床應(yīng)用上難以在短時間內(nèi)獲取大量樣本，因此高通量檢測的實用性在普通臨床檢驗上受到極大限制；PCR-RFLP是一種常用的廉價檢測方式，其原理基于內(nèi)切酶剪切，關(guān)鍵技術(shù)在于選擇合適的內(nèi)切酶及引物，若是存在錯配序列的話還需設(shè)計專門的錯配引物，因此極大的增加了研究難度，導(dǎo)致整體實驗時間延長[8]。因此，新的SNP基因分型方法亟待推廣。兩對引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR-confronting two-pair primers,PCR-CTPP)是一種新型的SNP基因分型方法，已有研究報道其已經(jīng)成功完成了超過30種不同的SNP分型[9]。本試驗以PCR-CTPP方法檢測在BER途徑3種蛋白的4個SNP位點(OGG1 Ser326Cys、APE1 Asp148Glu、-141T/G及XRCC1 Arg399Gln)，并與DNA測序結(jié)果進行比較，進一步探討該方法在基因SNP檢測與分析中的應(yīng)用價值。

1資料與方法

1.1一般資料本研究收集了第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心2014年1～6月住院非小細胞肺癌患者的血液樣本。所有患者均已經(jīng)病理學(xué)或細胞學(xué)確診。采用EZNASE血DNA試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,United States)提取每位患者的基因組DNA，并分裝凍存于-80 ℃。

表1　4種SNPs的引物序列及擴增片段長度

所提取的標(biāo)本用于檢測以下DNA位點：OGG1(rs1052133;Ser326Cys,C/G位于7號外顯子)，APE1(rs1130409;Asp148Glu,T/G位于5號外顯子及rs1760944;-141T/G位于啟動子區(qū))，以及XRCC1(rs25487;Arg399Gln,G/A位于10號外顯子)。試驗流程及標(biāo)本采集過程經(jīng)大坪醫(yī)院倫理委員會討論通過，并已獲得每位患者的知情同意書。

1.2方法

1.2.1引物序列根據(jù)GenBank，結(jié)合合適的退火溫度等條件設(shè)計引物序列，見表1。

1.2.2PCR-CTPP檢測與基因型判讀PCR擴增體系為25 μL，包括2 μL基因組DNA，12.5 μL Go Taq MIX(2x)及6.5 μL dH2O，每個體系里都包含有該位點的4種引物各1 μL。反應(yīng)條件為95 ℃變性10 min；同樣溫度下1 min為1個循環(huán)，共計30或32個循環(huán)；退火時間為1 min，溫度分別為64 ℃(OGG1 Ser326Cys)，60 ℃(APE1 Asp148Glu)，58 ℃(APE1 -141T/G)與66 ℃(XRCC1 Arg399Gln)；最后72 ℃下延長1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察條帶，判讀基因型。

1.2.3基因測序所有樣本完成PCR擴增后，將30例擴增產(chǎn)物送上海Sangon進行測序。

2結(jié)果

圖1A為OGG1 Ser326Cys瓊脂糖電泳結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3個位置都出現(xiàn)了條帶，最上的條帶位于446 bp處，可稱為條帶1；中間的條帶位置在252 bp處，為條帶2；而最末條帶位于194 bp處，稱為條帶3。第1、2、5、6、7條帶5個標(biāo)本條帶1、2、3皆有，提示為C/G型雜合產(chǎn)物，而第3、4標(biāo)本只有條帶1和3，提示為GG純合型，第8個標(biāo)本只有條帶1和2，則為CC純合型。圖1B、圖1C和圖1 D是其余3個基因的瓊脂糖電泳結(jié)果。根據(jù)圖1B可知第1、2、7、8、9條帶5個標(biāo)本為條帶1和條帶2，判定為GG純合型；第3個標(biāo)本為條帶1和條帶3，判定為TT純合型；第4、5、6條帶3個標(biāo)本均有，判讀為T/G雜合型。圖1C、D的判讀方法相同，圖1C提示第1、2和6個標(biāo)本為TT純合型，第5和7標(biāo)本為GG純合型，剩余為T/G雜合型；圖1D提示第1、4和5號標(biāo)本為GG純合型，第3號標(biāo)本為AA純合型，其余標(biāo)本為G/A雜合型。

L1400433標(biāo)本同4個位點的測序分析結(jié)果，根據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，PCR-CTPP結(jié)果與測序結(jié)果完全一致，證實實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠，見圖2。

A:OGG1 Ser326Cys；B:APE1 Asp148Glu；C:APE1-141T/G;D:XRCC1 Arg399Gln。

圖14個位點瓊脂糖電泳結(jié)果

圖2　4個SNP位點的測序結(jié)果

3討論

PCR-CTPP是由Hamajima等在2001年提出，它的設(shè)計原理是采用等位基因特異的兩對引物進行PCR擴增。對于一個SNP位點的X或Y堿基而言，X等位基因的一個引物(如1R反義引物)被設(shè)計為在3′端包含X′，即X等位基因的反義核苷酸；而它的對向引物(1F正向引物)則位于其上游a個bp的位置。同樣，Y等位基因的正義引物包含Y等位基因，其反義引物位于其下游b個bp的位置。其中兩個擴增片段的長短(a和b)必須有足夠大的區(qū)分度，以便于在瓊脂糖凝膠電泳的過程中能夠分離條帶并便于讀取。在這種設(shè)計下，另有一段長度為c的片段(由1F和2R擴增得到)，c的長度為a與b之和去掉由1R和2F擴增得到的片段長度，是整個產(chǎn)物中最長的片段[10]。經(jīng)過多年應(yīng)用中的不斷改良[9,11]，PCR-CTPP方法迄今已完成多種基因SNP位點的基因分型[12]。

既往采用的SNP分型方法包括直接測序、Taqman探針和PCR-RFLP法。前兩種方法是通過直接讀取DNA序列而得到不同分型，而PRC-RFLP則與CTPP法類似，也是先通過PCR擴增目的基因的方式，不同的是前者采用特異性的限制性內(nèi)切酶切割擴增產(chǎn)物，從而達到分型效果[13]。相對CTPP法而言，RFLP法由于酶切反應(yīng)導(dǎo)致耗時較長，且由于限制性酶切引物的設(shè)計限制了其在同一塊凝膠上同時觀察多個SNP位點基因型的能力，因此限制了其在臨床檢測的廣泛應(yīng)用。而CTPP法的分型則是在PCR擴增過程中完成，因此能夠彌補這兩點不足。PCR退火階段的溫度對于形成特定的DNA片段十分重要，由于PCR-CTPP方法的4種引物存在于同一反應(yīng)體系中，因此，4種引物的退火引物必須十分接近，以便在同一退火溫度下進行反應(yīng)。在本研究中所采用的4個基因的引物，其退火溫度介于58～66 ℃，符合反應(yīng)條件，在設(shè)定溫度下能夠使DNA片段順利形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物中最長的片段與DNA的完整性有一定關(guān)聯(lián)，濃度較低或保存較長時間的樣本其片段亮度較濃度高、保存時間短的樣本低，因此在未特殊設(shè)計陰陽性對照的條件時，可以參照這一片段情況進行判讀。

本研究通過PCR-CTPP的方法，與基因測序進行比對，確定了采用成對引物體系對BER途徑3個關(guān)鍵蛋白基因的4個SNP位點進行基因分型，得到的結(jié)果證實了PCR-CTPP方法是切實可行的。然而，由于這種方法的引物條件較為苛刻，綜合反應(yīng)體系成分較為復(fù)雜，且最終的判讀依賴瓊脂糖凝膠電泳的條帶，因此對于這種技術(shù)的進一步優(yōu)化仍需繼續(xù)進行。

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The role of polymerase chain reaction with confronting two-pair primers in SNP genotyping of DNA base excision repair genes

Peng Yang,Cheng Yi,Yang Yuxin,Li Chongyi,Li Mengxia,Zhang Shiheng,Wang Dong△

(CancerResearchCenterofFieldSurgeryInstitute,theAffiliatedDapingHospitalofThirdMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

[Abstract]ObjectiveIt is important to precisely determinate the single nucleotide polymorphisms (SNPs) in many genes including genes related with base excision repair (BER) pathway.This research is conducted to evaluate the role of polymerase chain reaction with confronting two-pair primers (PCR-CTPP) in analyzing the SNPs of BER pathway.MethodsFour common SNPs of BER pathway (OGG1 Ser326Cys,XRCC1 Arg399Gln,APE1 Asp148Glu and -141T/G in the promoter region) was detected with PCR-CTPP.10 of the products were sent for genotype sequencing.Compare the results of PCR and sequencing to evaluate the accuracy of PCR-CTPP.ResultsThe genotypes were exactly the same as the sequencing.ConclusionThe PCR-CTPP was a reliable and rapid detective technology for SNPs genotyping.Its broadest application would be great help for gene variant analysis.

[Key words]polymorphism,single nucleotide;polymerase chain reaction with confronting two-pair primers;base excision repair

作者簡介：彭楊(1988-)，本科，主要從事DNA分離與基因檢測研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:(023)68757151；E-mail:dongwang64@hotmail.com。

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.021

[中圖分類號]Q786

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2226-03

(收稿日期：2015-12-22修回日期：2016-03-01)