沈國雙，鄭方超，曹成珠，姬發(fā)祥，李進(jìn)章，王樹燕，趙久達(dá)△

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺科，西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，西寧 810000；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西安 810000)

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青海地區(qū)藏族FGFR2基因多態(tài)性與乳腺癌的相關(guān)性研究*

沈國雙1，鄭方超2，曹成珠3，姬發(fā)祥2，李進(jìn)章2，王樹燕2，趙久達(dá)2△

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺科，西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，西寧 810000；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西安 810000)

[摘要]目的探討成纖維細(xì)胞生長因子受體2(FGFR2)基因rs2981582、rs1219648 和 rs2420946位點基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族乳腺癌的相關(guān)性。方法采用病例對照研究的方法，收集青海地區(qū)210例藏族乳腺癌患者及230例藏族體檢健康女性的外周血標(biāo)本，提取基因組DNA，以Taqman-MGB探針PCR法及測序方法對兩組標(biāo)本的FGFR2 基因rs2981582、rs1219648 和 rs2420946位點進(jìn)行統(tǒng)計分型，分析其與青海地區(qū)藏族乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。結(jié)果藏族乳腺癌患者rs 2981582 位點CC、CT、TT頻率分別為40.48%、39.05 %、20.47%，健康對照組為36.09%、48.69%、15.22%，藏族乳腺癌患者rs1219648 位點GG、AG、AA頻率分別為24.76%、26.19 %、49.05%，健康對照組為23.91%、47.39%、28.70%，藏族乳腺癌患者rs2420946 位點CC、CT、TT頻率分別為29.05%、45.24%、25.71%，健康對照組為30.87%、51.74%、17.39%。兩組rs2981582和 rs2420946 各基因型位點基因型頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但存在于rs1219648位點的AA基因型其頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與GG基因型比較，AA基因型攜帶的女性發(fā)生乳腺癌的危險性增加[OR=1.65,95%CI=(1.01，2.69)]。結(jié)論FGFR2 rs1219648 AA基因型與青海地區(qū)藏族女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]FGFR2；基因多態(tài)性；乳腺腫瘤；藏族

乳腺癌的發(fā)病率約占女性惡性腫瘤的23%。以往乳腺癌在我國低發(fā)，但近年發(fā)病逐年升高，乳腺癌的發(fā)病已躍居于威脅女性健康的惡性腫瘤首位。乳腺癌病因尚不完全明確，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究普遍認(rèn)為乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與基因和環(huán)境的共同作用有直接的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2基因rs2981582、rs1219648和rs2420946中等位點單核苷酸多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病具有相關(guān)性[1-2]。FGFR2基因多態(tài)性的研究為臨床預(yù)防和治療乳腺癌的提供了可能。目前，尚未見FGFR2基因與藏族乳腺癌相關(guān)性的報道。本研究利用Taqman-MGB探針PCR法及測序方法檢測青海地區(qū)藏族女性FGFR2基因rs2981582、rs1219648和rs2420946位點的多態(tài)性，分析其與藏族地區(qū)乳腺癌發(fā)病的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料采集自2008年10月至2014年10月住院的的210例藏族乳腺癌患者(病例組)，各患者均就診于青海大學(xué)附屬醫(yī)院，且他們之間無血緣關(guān)系。術(shù)后取活檢，送往病理科，做病理組織學(xué)檢驗，入選的各患者此前都未行放療或化療，病例組平均年齡(54±6)歲。同期，采集本院健康體檢的230例青海地區(qū)藏族女性外周血標(biāo)本(健康對照組)，平均年齡(53±6)歲，年齡與病例組匹配。獲取的標(biāo)本冷凍于液氮瓶中，然后調(diào)整液氮溫度到-70 ℃?zhèn)溆?。所有患者及健康的體檢者均由試驗的參與者或其家屬簽署了知情同意書，為求進(jìn)一步完善試驗，此項研究獲得青海大學(xué)附屬醫(yī)院研究倫理委員會許可，審查合格予以進(jìn)行試驗研究。

表1　青海地區(qū)藏族FGFR2基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系[n(%)]

1.2方法

1.2.1外周血基因組DNA的提取外周血中基因組DNA的提取符合文獻(xiàn)操作規(guī)范[2]。

1.2.2基因分型以FGFR2的基因組序列(GenBank association number：NC_000010.10)為依據(jù)，分別設(shè)計了FGFR2基因擴(kuò)增rs2981582、rs1219648 和 rs2420946的全套引物和探針。使用Taqman-MGB探針PCR法進(jìn)行SNP分型。PCR總反應(yīng)體積為5 μL,包括100 ng/mL DNA 模板 1 μL，上下游引物分別0.1 μL、0.1 μL，TaqMan探針0.1 μL，2.5 μL反應(yīng)混合物，雙蒸水1.2 μL。在ABI Prismsm7900HT型熒光定量PCR儀上反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃溫度下預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃循環(huán)30 s，總共執(zhí)行40個循環(huán)。儀器啟動后自動收集熒光信號，應(yīng)用SDS軟件分析得出SNP的分型結(jié)果。結(jié)果分析：雙盲法為前提，運用統(tǒng)計學(xué)中單純隨機(jī)法原理，選取樣本中10%的病例個體，多次重復(fù)檢驗，結(jié)果顯示完全一致。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件中的Hardy-Weinberg平衡對各個基因型的分布頻率進(jìn)行分析，采用χ2檢驗表示健康對照組FGFR2基因rs2981582、rs1219648 和 rs2420946和青海藏族乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。用風(fēng)險比(OR)及95%CI來表示相對危險度。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg平衡的檢驗結(jié)果健康對照組的基因型分布頻率經(jīng)數(shù)據(jù)處理，分析顯示符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.50，P>0.05)，表明人組樣本具有群體代表性。

2.2基因分型結(jié)果在病例組患者與健康對照組中，檢測了FGFR2基因3個SNP位點多態(tài)性，其基因頻率見表1。FGFR2基因的rs2981582、rs1219648 和 rs2420946位點，分別以野生型CC、GG和CC基因型為參照，可見rs1219648位點AA基因型增加患乳腺癌的風(fēng)險(P<0.05)，而rs2981582和rs2420946位點各基因型均未增加乳腺癌風(fēng)險(P>0.05)。另外，抽取5%病例測序驗證，結(jié)果均符合，rs2981582、rs1219648 和 rs2420946位點的測序，見圖1～3。

A:C/C基因型CC;B:T/C雜合基因型CT;C:T/T基因型TT。

圖1rs2981582位點測序圖

A:A/A基因型AA;B:A/G雜合基因型AG;C:G/GT基因型GG。

圖2rs1219648位點測序圖

A:C/C基因型CC;B:T/C雜合基因型CT;C:T/T基因型TT。

圖3rs2420946位點測序圖

3討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個極為復(fù)雜的過程，目前認(rèn)為環(huán)境和基因共同在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用[3-4]。FGFR2是新近發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌發(fā)病有關(guān)的基因之一。FGFR2來源于纖維母細(xì)胞生長因子受體家族，是一種蛋白質(zhì)編碼的基因，在胚胎生長和細(xì)胞的修復(fù)中發(fā)揮了重要的作用，尤其是在骨骼和血管中大量存在。FGFR2在乳腺癌的腫瘤的生長中起著重要的作用，可以提供乳腺癌治療的新方法的發(fā)展。2007年Easton等[2]利用全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)了5個乳腺癌的易感區(qū)域，2015年由Michailidou等[5]對12萬份標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)15個新的易感區(qū)域，盡管有大量的此類研究，但與乳腺癌發(fā)病關(guān)系最密切的是位于FGFR2(rs2981582)和TNRC9(rs3803662)基因上的多態(tài)性位點[1]。之后國內(nèi)外進(jìn)行了一些有關(guān)FGFR2與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的研究，且在Hunter等[6]的研究中，選取的病例組1 145例和健康對照組的1 142例，表明FGFR2基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病密切相關(guān)[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR2基因rs2981582 和 rs2420946多態(tài)性在病例組和健康對照組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而病例組患者FGFR2基因rs1219648和健康對照組AA基因型攜帶間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.16，P<0.05)。病例組藏族乳腺癌AA基因型的女性發(fā)生的危險性增加[OR=1.65,95%CI(1.01，2.69)]。

本研究結(jié)果FGFR21219648基因與藏族乳腺癌有相關(guān)性與Andersen等[7]的研究一致。Andersen等[7]通過研究869例乳腺癌和808例對照組后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR21219648增加美國女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險，且與既往雌激素及孕激素治療無關(guān)。與此同時，Saadatian等[8]選取了100例患病女性乳腺癌患者組和100例健康的伊朗健康女性進(jìn)行試驗研究，同樣證實了rs1219648增加了伊朗女性乳腺癌的發(fā)病。而FGFR2基因rs2981582 和 rs2420946與藏族乳腺癌不存在相關(guān)性，與國內(nèi)Liang等[9]，國外Raskin等[10]研究不一致，以上兩位研究者的結(jié)論都是有相關(guān)性。分析原因可能為：(1)病例選擇的局限性。本課題選擇的樣本乳腺癌均來自于本院，對照組來自于本院體檢健康人群，提示選擇偏倚的存在。(2)樣本量偏小。由于藏族乳腺癌患者少，本課題選取的總體例數(shù)相對較小，而在國外，如Michailidou等[5]的研究樣本量較大，因此也可能導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)上的差異。(3)FGFR2的基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系，在不同種族和民族可能有差異。本研究選擇的人群為青海藏族，而其他作者選擇的是中國漢族或者國外人群。(4)病例選擇上年齡區(qū)間的問題，病例組選擇的是(54±6)歲的藏族乳腺癌患者，健康對照組選擇的是(54±6)歲的健康藏族人，所以在病例年齡的選擇上具有一定的局限性，下一步可考慮擴(kuò)大試驗組年齡范圍。(5)未進(jìn)行區(qū)域飲食環(huán)境的劃分，在Murillo-Zamora等[11]的研究中發(fā)現(xiàn)，rs2981582單基因多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)，且與飲酒有相關(guān)性，并且酒精和乳腺癌發(fā)病有高度的相關(guān)性有其他充分的證據(jù)[12-13]，為以后增加酒精飲食組和非酒精飲食組的劃分提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)存在FGFR2 rs1219648基因多態(tài)性的青海藏族女性，乳腺癌的發(fā)病相應(yīng)的顯著增加，由于不同種族的遺傳背景，以及飲食存在差異，再者，由于病例對照試驗的局限性，需要以后擴(kuò)大樣本量及增加與其他人群年齡組的對照研究，才能為以后乳腺癌的防治提供更多臨床的依據(jù)。

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The correlation study between FGFR2 gene polymorphisms and breast cancer in Qinghai Tibetan areas*

Shen Guoshuang1,Zheng Fangchao2,Cao Chengzhu3,Ji Faxiang2,Li Jinzhang2,Wang Shuyan2,Zhao Jiuda2△

(1.DepartmentofBreastThyroidSurgery,theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining,Qinghai810000,China;2.DepartmentofMedicalOncology,theAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,Xining,Qinghai810000,China;3.MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining,Qinghai810000,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the relationship between the fibroblast growth factor 2 (FGFR2) gene polymorphism (rs 2981582,rs 1219648,rs 2420946) and the breast cancer risk in Tibetan population,Qinghai province.MethodsThis is a case control study.Peripheral blood samples from 210 breast cancer patients and 230 healthy women in Qinghai area were collected.DNA samples were extracted from peripheral blood cells.FGFR2 gene polymorphism (rs 2981582,rs 1219648,rs 2420946) were typed by Taqman-MGB probe based on PCR and DNA sequencing,then analyzed its correlation with breast cancer in Tibetan population,Qinghai province.ResultsThe genotype frequencies of rs 2981582 CC,CT and TT were 40.48%,39.05% and 20.47% among the breast cancer patients while 36.09%,48.69% and 15.22% among the controls.The genotype frequencies of rs 1219648 GG,AG and AA were 24.76%,26.19 % and 49.05% among the patients while 23.91%,47.39% and 28.70% among the controls.The genotype frequencies of rs 2420946 CC,CT and TT were 29.05%,45.24% and 25.71% among the patients while 30.87%,51.74% and 17.39% among the controls.The genotype frequencies of all genetic loci had no significant difference between rs 2981582 and rs 2420946 (P>0.05).But the genotype frequencies of rs 1219648 AA have statistical sense(P<0.05),compared with GG,the incidence of breast cancer was remarkably increased with AA[OR=1.65,95%CI=(1.01,2.69)].Conclusion This study shows that FGFR2 rs1219648 AA is related to breast cancer risk among Tibetan population.

[Key words]FGFR2;gene polymorphism;breast neoplasms;Zang nationality

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.015

*基金項目：教育部春暉項目(z2011006)。

作者簡介：沈國雙(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺癌遺傳和治療研究?！魍ㄓ嵶髡?，Tel:(0971)6162732;E-mail:jiudazhao@126.com。

[中圖分類號]R394.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2209-03

(收稿日期：2015-12-08修回日期：2016-02-22)