王宇洲，許建華，常偉華，付航瑋，皮儒先，陳　健，陳　平

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所,重慶 400042)

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長鏈非編碼RNA LOC100288637在原發(fā)性肝癌中差異性表達的生物學意義及相關機制研究*

王宇洲，許建華，常偉華，付航瑋，皮儒先，陳健，陳平△

(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所,重慶 400042)

[摘要]目的研究長鏈非編碼RNA(LncRNA) LOC100288637在肝癌中的表達差異，對肝癌細胞增殖的影響及相關機制。方法分析GEO數(shù)據集GSE58043和GSE10694，得出LOC100288637及hsa-miR-101-3p在肝癌組織中差異表達，RNA-hybrid分析LOC100288637與hsa-miR-101-3p的結合具有可能性。逆轉錄-聚合酶鏈式反應在組織和細胞水平檢測LOC100288637表達量。熒光原位雜交觀察LOC100288637在細胞中的定位。敲低LOC100288637后CCK-8檢測細胞增殖情況。過表達hsa-miR-101-3p后，檢測LOC100288637的變化。結果LOC100288637在肝癌組織中的表達量高于癌旁組織 (P<0.05)；LOC100288637在肝癌細胞系中的表達量高于肝細胞系(P<0.05)。LOC100288637在HepG2細胞核質均有表達，以細胞質居多。敲低LOC100288637后HepG2細胞增殖活性降低(P<0.01)。過表達hsa-miR-101-3p后，LOC100288637表達量下降(P<0.05)。結論LncRNA LOC100288637可能在肝癌發(fā)生，發(fā)展過程中起重要作用并接受hsa-miR-101-3p靶向調控影響肝癌細胞的增殖。

[關鍵詞]肝腫瘤；增殖；LOC100288637；101-3p

肝細胞肝癌(hepatocelluer carcinoma，HCC)，是常見的惡性腫瘤，具有較高的病死率，預后較差[1-2]。目前，手術治療及化學治療仍為肝癌治療的主要手段，而肝癌患者的預后很大程度上取決于診斷、治療的時期及個體差異[3-4]。非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)根據其長度，可分為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)及非編碼微小RNA(microRNA，miRNA)等[5]。在人類LncRNA占據非編碼RNA的大多數(shù)，目前的研究表明它可以在不同水平調控細胞活動，既可以在轉錄水平調節(jié)基因的轉錄，也可以在轉錄后對蛋白質的修飾等進行調控，它可以促進或抑制基因的轉錄，也可以調節(jié)相應蛋白質的功能[6-10]。已有研究表明,LncRNA的失調與肝癌，以及其他腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。例如NEAT1在肝癌組織中高表達，并且NEAT1對臨床上肝癌的發(fā)生、發(fā)展有促進作用，包括癌結節(jié)的數(shù)目、肝癌的TNM分級、肝癌的轉移以及門靜脈癌栓的形成[11]；BRAF-activated non-coding RNA (BANCR)能夠對胃癌的發(fā)生、發(fā)展起到促進的作用等[12]。到目前為止，仍有大量未經研究的LncRNA可能與原發(fā)性肝細胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系。因此，為了更加深入地發(fā)掘肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，針對與肝癌有關的LncRNA的研究具有重要意義。本研究通過對美國國立生物技術信息中心(NCBI)GEO數(shù)據庫的數(shù)據集GSE58043、GSE10694進行分析，明確LncRNA LOC100288637，miRNA 101-3p在肝癌組織和癌旁組織中存在差異性表達，通過RNA-hybrid進行生物信息學分析得出LOC100288637與hsa-miR-101-3p的結合具有可能性[13],并在組織學及細胞學水平明確LOC100288637在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的意義，以及受到hsa-miR-101-3p的靶向調控。

1材料與方法

1.1材料選取2015年3月至2015年6月，本院行手術切除并經病理確診的10例原發(fā)性肝癌的肝癌組織及配對癌旁組織樣本，所有病例術前均未行化療、放療及免疫治療，癌旁組織取自上述癌組織切緣3 cm之外，樣本獲取后立即將樣本浸入RNAfixer并保存于-80 ℃冰箱中。人類肝癌細胞系(HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704)和人類正常肝細胞系(LO2)均保存于本科，該原始細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。主要試劑及材料：培養(yǎng)基、血清、胰酶、青霉素及鏈霉素均購自重慶卡爾波生物技術有限公司；引物為上海生物工程有限公司合成；轉染試劑脂質體2000及Trizol試劑 購自Invitrogen (美國)公司；cDNA第一聯(lián)合成試劑盒及實時熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；siRNA、mimics、Exiqon miRCURY LNA LncRNA 原位雜交探針、緩沖液等購自蘇州瑞博生物技術有限公司； Cell Counting Kit (CCK-8)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，其他試劑均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析于NCBI的GEO數(shù)據庫獲得數(shù)據集GSE58043(含7對肝癌及癌旁組織的部分LncRNA芯片)和數(shù)據集GSE10694(含78對肝癌及癌旁組織，以及10例正常肝組織的部分miRNA芯片)，使用R語言進行基因差異性分析。使用RNA-hybrid預測LOC100288637與hsa-miR-101-3p的相互作用位點。

1.2.2細胞培養(yǎng)向75 cm2培養(yǎng)瓶中加入DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(占總培養(yǎng)基10%)、50 U/mL青霉素和50 U/mL鏈霉素，分別接種HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704及LO2細胞，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)。

1.2.3總RNA 抽提、逆轉錄及RT-PCR 反應用Trizol 試劑提取細胞及組織總RNA(方法按說明書步驟)，紫外分光光度計測定其純度及濃度。根據Themo說明逆轉錄合成cDNA 的第一鏈。以合成的cDNA 為模版,擴增LOC100288637和GAPDH基因。LOC100288637引物序列：上游引物為5′-TCC TTT CCC CGC TGT TCT AAT TG-3′，下游引物為5′-TGA GAC CAC AGC GCC TGA GAA C-3′；GAPDH作為內參，其上游引物為5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游引物為5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。RT-PCR反應體系為20 μL，反應條件94 ℃預變性2 min,94 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸15 s,共45個循環(huán)。以LOC100288637產物的熒光強度比上GAPDH 擴增產物的熒光強度的相對量代表LOC100288637的相對表達情況。每個實驗重復3 次。以水為模板擴增的反應作為PCR 擴增的陰性對照。

1.2.4熒光原位雜交(FISH)取生長狀態(tài)良好并處在對數(shù)生長期的HepG2細胞，于24孔培養(yǎng)板中置入10 mm×10 mm玻片，按照每孔5×103細胞密度接種于24空板中，24 h后去除上清，4%多聚甲醛固定后，0.1%Triton X-100通透，預雜交液37 ℃預雜交，LOC100288637探針 42 ℃雜交16～20 h。然后用2×SSC沖洗，滴加DAPI于切片雜交區(qū)域，10 min，PBS清洗后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5siRNA-LOC100288637干擾實驗取生長狀態(tài)良好并處在對數(shù)生長期的HepG2細胞，按照每孔5×103細胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。將HepG2細胞分為2組，即對照組及siRNA-LOC100288637干擾組，待細胞貼壁后，按脂質體2000 的說明書操作，混勻脂質體2000和LOC100288637 的siRNA，室溫放置20 min后，將其滴入培養(yǎng)有HepG2 的培養(yǎng)板中，混勻培養(yǎng)，對照組將脂質體2000空載體滴入培養(yǎng)有HepG2 的培養(yǎng)板中。培養(yǎng)4～6 h后換為含血清的培養(yǎng)基。48 h后RT-PCR檢測siRNA 的干擾效率。LOC100288637的siRNA序列為序列1：正義鏈5′-CCA CUA GUA UAC UAU UAA AUU-3′，反義鏈5′-UUU AAU AGU AUA CUA GUG GGG-3′；序列2：正義鏈5′-GGA CGU AUA UGC UGU GUA AAG-3′，反義鏈5′-UUA CAC AGC AUA UAC GUC CCU-3′；序列3：正義鏈5′-GGU CAC UAU AAC AAA UAU AAU-3′，反義鏈5′-UAU AUU UGU UAU AGU GAC CUG-3′。

1.2.6CCK8細胞增殖實驗調整HepG2細胞密度接種于96孔板，每孔種約3×103個細胞，設對照組和實驗組，每組設6個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后轉染。對照組加入脂質體2000空載體，實驗組轉染LOC100288637的siRNA。分別于轉染12、24 h后從培養(yǎng)箱取出加入CCK8試劑，每孔100 μL培養(yǎng)液中加入10 μL CCK8試劑，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后取出，使用酶標儀測定450 nm處各孔吸光度(A)值，以反映細胞數(shù)目。

1.2.7has-miR-101-3p模擬物轉染取生長狀態(tài)良好并處在對數(shù)生長期的HepG2細胞，按2×104細胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，將HepG2細胞分為2組，即對照組和has-miR-101-3p模擬物組，待細胞貼壁后，按脂質體2000 的說明書操作，混勻脂質體2000和has-miR-101-3p模擬物，室溫放置20 min后，將其滴入培養(yǎng)有HepG2 的培養(yǎng)皿中，混勻培養(yǎng)，對照組將脂質體2000空載體滴入培養(yǎng)有HepG2 的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)4～6 h后換為含血清的培養(yǎng)基。24 h后RT-PCR 檢測LOC100288637的表達量。has-miR-101-3p模擬物序列：正義鏈5′-UAC AGU ACU GUG AUA ACU GAA-3′，反義鏈5′-CAG UUA UCA CAG UAC UGU AUU-3′。

2結果

2.1生物信息學分析結果本研究表明，LOC100288637，has-miR-101-3p在肝癌組織及配對癌旁組織中存在差異性表達，且兩者有相互作用位點。對GEO數(shù)據庫的數(shù)據集GSE58043、GSE10694進行分析，7對肝癌組織及癌旁組織的差異基因表達分析，LOC100288627在肝癌組織中呈高表達，在癌旁組織中低表達。78對肝癌組織及癌旁組織的差異基因表達分析顯示，has-miR-101-3p在肝癌組織中呈低表達，在癌旁組織中高表達。通過RNA-hybrid進行生物信息學分析得出LOC100288637與hsa-miR-101-3p的結合具有可能性，且明確了兩者的結合空間結構及結合位點。

2.2LOC100288637在肝癌組織及肝癌細胞系中高表達運用逆轉錄PCR檢測手術切除的10 例肝癌組織和配對癌旁組織，以及5種肝癌細胞株和一種正常肝細胞株中LOC100288637的表達量(圖1)，LOC100288637在臨床患者的肝癌組織和癌旁組織中的相對表達量分別為1.80±1.35、0.53±0.34，LOC100288637在臨床患者的肝癌組織中的表達量高于癌旁組織中表達量，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=22.94，P<0.05)；LOC100288637在肝癌細胞系(HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704)中的相對表達量分別為0.88±0.05、1.34±0.17、0.85±0.07、1.00±0.17、0.58±0.04，在正常肝細胞系(LO2)中的相對表達量為0.10±0.01，LOC100288637在5組肝癌細胞系中的表達量均明顯高于在肝細胞系LO2中的表達量，5組肝癌細胞系分別與LO2細胞系比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=24.47、12.56、18.41、9.08、18.38，P<0.05)，見圖1。

2.3FISH檢測結果FISH證實LOC100288637在胞質及胞核中均有分布，以胞質中的分布居多。使用LOC100288637探針對HepG2細胞株進行原位雜交，滴加熒光染料后，熒光顯微鏡下觀察，見圖2。

2.4向HepG2細胞轉染siRNA能有效干擾LOC100288637的表達應用脂質體2000 介導的方法向HepG2細胞轉染LOC100288637的siRNA，RT-PCR檢測轉染后細胞內LOC100288637的表達量，LOC100288637-siRNA組和LOC100288637-對照組的LOC100288637表達量分別為5.12±0.15,38.97±3.98,LOC100288637-siRNA組的LOC100288637表達量低于LOC100288637-對照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=14.72，P<0.01)，見圖3。

2.5敲低LOC100288637能有效抑制HepG2細胞增殖使用siRNA敲低LOC100288637后，CCK8細胞增殖實驗檢測細胞的增殖活性。LOC100288637-siRNA組的細胞增殖活性明顯低于LOC100288637-對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=139.80、191.40，P<0.01)，見圖4。

A：LOC100288637在HepG2、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Bel-7704及LO2中表達水平;B：LOC100288637在10個患者組織標本中肝癌及癌旁表達水平。

圖1RT-PCR檢測LOC100288637在細胞系中

表達水平及患者組織標本中表達量

圖2　熒光原位雜交檢測LOC100288637在HepG2細胞中的分布

圖3　LOC100288637的干擾序列(siRNA)能有效降低

圖4　LOC100288637的干擾序列(siRNA)能有效

2.6hsa-miR-101-3p能夠抑制LOC100288637表達用脂質體2000向HePG2肝癌細胞轉染hsa-miR-101-3p的模擬物，RT-PCR檢測轉染后LOC100288637的表達量。miR-101-3p mimics組和miR-101-3p 對照組的LOC100288637表達量分別為0.08±0.00，1.00±0.05，miR-101-3p mimics組的LOC100288637表達量低于miR-101-3p對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=29.48，P<0.05)，見圖5。

圖5　hsa-miR-101-3p能有效抑制LOC100288637的表達

3討論

肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，對于人類健康造成嚴重威脅，目前人們對肝癌的發(fā)病機制尚未完全了解[1-4]，手術切除仍然是目前最主要的治療方式，但是手術后復發(fā)和轉移仍然影響患者的長期生存，因此，為了尋找對于肝癌的其他的診斷及治療方式，探索肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制已成為目前的一個研究重點。

LncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA 分子，它們并不編碼蛋白，而是以RNA 的形式在多種層面上(表觀遺傳調控、轉錄調控以及轉錄后調控等)調控基因的表達水平。盡管LncRNA曾被認為是轉錄“噪音”，但近年來在臨床及細胞實驗等多方面對于LncRNA的深入研究表明LncRNA是一種具有多種生物學功能的非編碼RNA，它在細胞增殖、細胞周期、細胞分化、細胞凋亡，以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等方面都具有非常重要的作用[6-10]。

近年來針對LncRNA對肝癌發(fā)生、發(fā)展的影響方面的研究已成為目前研究肝癌分子機制的一個熱點，已有一些研究表明多種LncRNA可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，例如Yu等[14]發(fā)現(xiàn)Metallothionein 1D,Pseudogene (MT1DP)能夠通過抑制FoxA1的蛋白合成負向調控AFP，抑制肝癌細胞的增殖并且促進肝癌細胞凋亡。Huang等[15]發(fā)現(xiàn)INK4基因座中反義非編碼RNA(ANRIL)在HCC組織中高表達，在體內和體外實驗中敲低ANRIL均可以抑制肝癌細胞的增殖并且可以促進肝癌細胞凋亡。更重要的是，一些LncRNA已經被公認為癌癥診斷及治療的靶點，比如通過檢測H19、HOTAIR等可以肝癌、胃癌、乳腺癌等的診斷提供幫助。這些經研究證實對腫瘤發(fā)生、發(fā)展有重要作用的LncRNA都有一個共同特點，即在腫瘤組織和正常組織中存在差異性表達，而這一點對進行有關LncRNA和腫瘤的研究具有重要的指導作用。

在本研究中，通過對GEO數(shù)據庫的數(shù)據集GSE58043和數(shù)據集GSE10694進行分析，得出LncRNARNA LOC100288637在肝癌組織中高表達，而miRNA-101-3p在肝癌組織中低表達的趨勢，因此考慮LOC100288637可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，并且不排除has-miR-101-3p與LOC100288637存在聯(lián)系。進一步通過序列比對預測分析(RNA-hybrid)，明確has-miR-101-3p和LOC100288637的結合空間結構及結合位點，為兩者間存在作用關系找到了理論依據。通過RT-PCR檢測LOC100288637表達量，發(fā)現(xiàn)LOC100288637在肝癌組織及肝癌細胞中高表達，而相應的癌旁組織及正常肝細胞則低表達該LncRNA，從細胞和組織學水平證實了LOC100288637的差異性表達。熒光原位雜交實驗進一步驗證了LOC100288637在肝癌細胞中表達，其主要分布于細胞質中。通過使用siRNA干擾LOC100288637的表達，HepG2肝癌細胞的增殖能力明顯降低，說明LOC100288637能調控肝癌細胞的增殖。向HepG2肝癌細胞轉染has-miR-101-3p的模擬物，上調has-miR-101-3p后，LOC100288637的表達量明顯下降，說明has-miR-101-3p能調控LOC100288637的表達。

綜上所述，LncRNA LOC100288637在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，且受到has-miR-101-3p的調控；LncRNA LOC100288637可能可以作為肝癌治療的一個潛在生物標學靶點。但LncRNA LOC100288637在肝癌侵襲轉移及腫瘤干細胞相關方面是否存在一定的作用，課題組尚在研究之中。

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Research on the biological significance of the LncRNA LOC100288637 expression differences in primary hepatic carcinoma and the related mechanism*

Wang Yuzhou,Xu Jianhua,Chang Weihua,Fu Hangwei,Pi Ruxian,Chen Jian,Chen Ping△

(FieldSurgeryResearchInstitute,theAffiliatedDapingHospitaloftheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression differences of long noncoding RNA(LncRNA) LOC100288637 in liver cancer,the effect of LOC100288637 on liver cancer cell proliferation and the relevant mechanisms.MethodsBased on the analysis of the GEO database data sets GSE58043 and GSE10694,we found that both LOC100288637 and hsa-miR-101-3p has obvious expression differences in liver cancer tissues.RNA hybrid revealed the possibility of combination between LOC100288637 and hsa-miR-101-3p;RT-PCR was performed to measure the expression level of LOC100288637 in tissues and cells;fluorescence in situ hybridization was used to observe LOC100288637 localization in cells;cell proliferation was determined by CCK8 experiment after LOC100288637 siRNA knock down.The expression of LOC100288637 in cells were measured after treated with hsa-miR-101-3p mimics.ResultsRelative quantitative expression of LOC100288637 in liver cancer tissues group was significantly higher than that in no tumor tissues group (P<0.05);relative quantitative expression of LOC100288637 in liver cancer cell lines were significantly higher than that in normal liver cell line(P<0.05).LOC100288637 was located in both cytoplasm and nucleus of HepG2 cells,and mainly in cytoplasm.Cell proliferation vitality of HepG2 reduced after treated with LOC100288637-siRNA(P<0.01).Relative quantitative expression of LOC100288637 in HepG2 reduced after treated with hsa-miR-101-3p mimics(P<0.05).ConclusionLncRNA LOC100288637 may play an important role in liver cancer development,it can be down regulated by hsa-miR-101-3p and affect the proliferation of liver cancer cells.

[Key words]liver neoplasms;proliferation；LOC100288637;miRNA-101-3p

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.012

*基金項目:國家自然科學基金面上項目(81270523)。

作者簡介：王宇洲(1989-)，醫(yī)師，碩士，主要從事肝癌及肝再生方面研究?！魍ㄓ嵶髡?Tel:13708349071；E-mail:chenping@263.net。

[中圖分類號]R394.2；R73-35；R735.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2198-04

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-06)