鄧婷婷，譚　紅，毛　亮，聶敏海

(西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室/心血管醫(yī)學(xué)研究所心肌電生理實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000)

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4NQO誘導(dǎo)大鼠舌黏膜癌變過程中波形蛋白的表達(dá)研究*

鄧婷婷，譚紅，毛亮，聶敏?！?/p>

(西南醫(yī)科大學(xué)口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室/心血管醫(yī)學(xué)研究所心肌電生理實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000)

[摘要]目的研究舌黏膜癌變過程各階段中波形蛋白的表達(dá)，探討其在舌鱗狀細(xì)胞癌(TSCC)發(fā)生、發(fā)展中的意義。方法采用4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)飲水法誘導(dǎo)大鼠TSCC的發(fā)生，收集發(fā)生過程中正常舌黏膜、上皮單純?cè)錾⑤p度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生及TSCC組織標(biāo)本共56例。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)波形蛋白的表達(dá)情況，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測(cè)各組織的波形蛋白mRNA表達(dá)量。結(jié)果免疫組織化學(xué)中，隨著大鼠舌黏膜異常增生程度的增加，波形蛋白表達(dá)陽性率明顯上升，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.685，P<0.05)。病變各組與正常舌黏膜組比較，mRNA表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輕度、中重度上皮異常增生組、鱗癌組與上皮單純?cè)錾M進(jìn)行比較，鱗癌組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上皮單純?cè)錾?、輕度、中重度上皮異常增生組、鱗癌組波形蛋白 mRNA表達(dá)量分別是正常舌黏膜組的1.22、1.28、1.29、1.42倍。結(jié)論在4NQO誘導(dǎo)大鼠舌黏膜癌變過程中，波形蛋白隨病變程度的增加表達(dá)增高，這與腫瘤的侵襲密切相關(guān)，有可能作為舌黏膜上皮癌變的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]波形蛋白；mRNA；舌鱗狀細(xì)胞癌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；4-硝基喹啉-1-氧化物

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)約占我國(guó)口腔頜面部惡性腫瘤的32．3%，侵襲力強(qiáng)，惡性程度高，嚴(yán)重威脅著人類健康。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指具有極性的上皮細(xì)胞向具有運(yùn)動(dòng)能力的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換并獲得遷移和侵襲能力的過程，是一種細(xì)胞在發(fā)育過程中的正常程序，如胚胎發(fā)生、組織重構(gòu)和癌癥等疾病的發(fā)生[1]。近年來的研究認(rèn)為，EMT在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中扮演了重要角色，上皮經(jīng)歷EMT后發(fā)生一系列生物學(xué)改變，包括細(xì)胞極性消失、細(xì)胞間連接喪失、細(xì)胞游走或散在分布、上皮標(biāo)志物缺失而間充質(zhì)標(biāo)志物重新表達(dá)等[2]。波形蛋白(vimentin)主要表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞，多種上皮源性腫瘤中均可出現(xiàn)波形蛋白的異常表達(dá)，波形蛋白陽性提示腫瘤發(fā)生了EMT，可作為上皮源性腫瘤的預(yù)測(cè)指標(biāo)。多年來，盡管學(xué)者對(duì)TSCC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制進(jìn)行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)在TSCC細(xì)胞中波形蛋白高表達(dá)，但未對(duì)癌變過程中各階段的變化進(jìn)行連續(xù)研究，為探究TSCC發(fā)生過程中波形蛋白的變化，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠TSCC模型，采用免疫組織化學(xué)及實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測(cè)波形蛋白在癌變各階段的表達(dá)變化，探討波形蛋白在TSCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和意義。

1材料與方法

1.1材料4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO，美國(guó)Sigma公司)，RNA提取試劑盒(TIANGEN生化科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑(日本TOYOBO公司)，QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit(德國(guó)QIAGEN公司)，兔抗鼠vimentin[EPR3776]多克隆抗體(abcam公司)，免疫組織化學(xué)染色試劑盒(SP-0023)、DAB試劑盒(博奧森生物技術(shù)有限公司)。 在屏障環(huán)境下建立封閉群SD大鼠的TSCC模型。將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.004%的4NQO水溶液，作為飲水給予64只SD大鼠自行飲用，分成A、B、C、D、E實(shí)驗(yàn)組，F(xiàn)組為對(duì)照組，每周觀察大鼠口腔黏膜的變化，并在第10周(A)、14周(B)、18周(C)、22周(D)、24周(E、F)分5批處死，采集口腔黏膜標(biāo)本，從中分為兩部分，一部分于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冷凍備用，另一部分固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h內(nèi)石蠟包埋，切片，HE染色，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生共同讀片確定病變性質(zhì)和病理分級(jí)，病理分級(jí)參考2005年WHO標(biāo)準(zhǔn)分為上皮單純?cè)錾?，輕、中、重度上皮異常增生和鱗癌5個(gè)等級(jí)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說明操作。兔抗鼠波形蛋白多克隆抗體(1∶250)，用微波爐處理修復(fù)波形蛋白抗原。免疫組織化學(xué)結(jié)果采用半定量評(píng)估法。陽性細(xì)胞數(shù)記分：高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)每100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，將5個(gè)視野的百分?jǐn)?shù)取平均值作為判定結(jié)果。計(jì)數(shù)陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：波形蛋白表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性。組織染色強(qiáng)度記分：無染色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；陽性細(xì)胞數(shù)比例記分：陽性細(xì)胞數(shù)小于10%(0分)；11%～25%(1分)；26%～49%(2分)；≥50%(3分)；每張切片細(xì)胞染色總分為染色強(qiáng)度記分與陽性細(xì)胞數(shù)得分之和。總分分值結(jié)果判斷：陰性0～1分；弱陽性(+)2分；中陽性(++)3～4分；強(qiáng)陽性(+++)5～6分。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)按試劑盒說明操作?？俁NA的提取和逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增波形蛋白 RNA，并做3個(gè)復(fù)孔，按程序進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性 10 min,95 ℃ 孵浴15 s,60 ℃ 孵浴15 s，72 ℃孵浴 30 s， 44個(gè)循環(huán)，72 ℃ 孵浴10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL加1 uL 6×DNA Loading Buffer混勻點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳。用RT-PCR分別檢測(cè)各組織標(biāo)本中波形蛋白基因和β-actin基因的CT值。然后依據(jù)原理公式計(jì)算2-△△CT值求得各個(gè)病變組組織中波形蛋白 mRNA相對(duì)于正常組組織中波形蛋白 mRNA的表達(dá)量(公式：△CT= CT波形蛋白-CTβ-actin，△△CT=Average△CT各病變組-Average△CT正常組)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同病理分級(jí)舌黏膜組織中表達(dá)的組間比較，采用等級(jí)資料的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)(Kruskal-wallis)，各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間數(shù)據(jù)的比較采用秩和檢驗(yàn)分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法矯正檢驗(yàn)水準(zhǔn)α′=0.007(α′=α/n，n為兩兩比較的次數(shù))。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠舌黏膜的變化情況第8周大鼠舌黏膜開始發(fā)生變化，出現(xiàn)白色粗糙斑點(diǎn)或斑片。隨著飲用4NQO水溶液時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸出現(xiàn)舌體充血糜爛面，乳頭狀瘤或潰瘍。至22周，超過1/3大鼠在舌根部及舌中部側(cè)緣形成潰瘍或新生物，見圖1。

2.2大鼠組織病理學(xué)變化隨著飲用致癌藥物的增加，大鼠舌黏膜上皮異常增生程度呈逐漸加重趨勢(shì)，見表1、圖2。

2.3大鼠舌黏膜中波形蛋白免疫組織化學(xué)表達(dá)情況在正常舌黏膜上皮中是沒有染色的，而波形蛋白主要表達(dá)在黏膜下結(jié)締組織的間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而在TSCC組織中，波形蛋白陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，特別在腫瘤浸潤(rùn)區(qū)域波形蛋白表達(dá)尤為顯著(χ2=10.685,P<0.05)，見表2、圖3。

表1　大鼠舌黏膜病變組織病理學(xué)診斷[n(%)]

表2　不同病變階段波形蛋白的表達(dá)

表3　不同病變階段波形蛋白 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果

a:各組與正常舌黏膜組比較；b：各組與上皮單純?cè)錾M比較；*：以α′=α/7=0.007為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　實(shí)驗(yàn)組大鼠TSCC大體觀察

圖2　大鼠TSCC(HE,×200)

A：正常黏膜組；B：輕度上皮異常增生；C：中度上皮異常增生；D：TSCC。

圖3各組大鼠舌黏膜波形蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果(×400)

2.4大鼠舌黏膜中波形蛋白mRNA的表達(dá)情況結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，各組波形蛋白 mRNA相對(duì)表達(dá)量均較高，與上皮單純?cè)錾M比TSCC組的波形蛋白 mRNA相對(duì)表達(dá)量較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3、圖4～6。取正常組2-△△CT值為1，其余各病變組2-△△CT值分別為1.22、1.28、1.29、1.42。即上皮單純?cè)錾M、輕、中、重度上皮異常增生組、鱗癌組織中波形蛋白 mRNA表達(dá)量分別是正常組中表達(dá)量的1.22、1.28、1.29、1.42倍。

圖4　大鼠不同病理階段波形蛋白mRNA △CT值

A、B：β-actin、波形蛋白擴(kuò)增曲線圖；C、D：β-actin、波形蛋白溶解曲線圖。

圖5大鼠舌黏膜樣品中波形蛋白 mRNA的表達(dá)情況

M：標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物Marker(600 bp)；1：正常組；2：上皮單純?cè)錾?：輕度上皮異常增生；4：中重度上皮異常增生；5：TSCC；6：鱗癌組β-actin。

圖6波形蛋白 mRNA RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶

3討論

TSCC作為口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，高侵襲、高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)的特點(diǎn)使其生存率一直無法提高，對(duì)TSCC病例進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，患者死亡的主要原因是局部復(fù)發(fā)和區(qū)域轉(zhuǎn)移[3]。4NQO還原酶在其致癌過程中起著關(guān)鍵作用，腫瘤相對(duì)更易發(fā)生于4NQO還原酶含量高的區(qū)域，從而使得此類模型病變器官具有明顯的靶向性[4]。常見的含有活化4NQO酶的動(dòng)物中，大鼠舌背黏膜含量最高[5]，這是本研究選用大鼠的重要依據(jù)之一。因此，本實(shí)驗(yàn)采用4NQO飲水法誘導(dǎo)SD大鼠TSCC發(fā)生，發(fā)現(xiàn)10周后全身狀況開始變差，病理結(jié)果顯示有53.33%舌黏膜呈上皮過度角化，33.33%上皮呈輕度異常增生。隨著飲用致癌藥物的增加，大鼠舌黏膜上皮異常增生程度呈逐漸加重趨勢(shì)。這與人類TSCC發(fā)生、發(fā)展過程相似，且與Sakaki等[6]用4NQO飲水法建立大鼠TSCC模型的表現(xiàn)一致。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中僅收集到2個(gè)重度上皮異常增生的樣本，推測(cè)可能是向癌變過渡的時(shí)間段十分短暫，也可能是不同大鼠在同樣時(shí)間段攝入的4NQO量不同，或者不同大鼠的自身抗癌能力存在差異。實(shí)驗(yàn)全過程中意外死亡實(shí)驗(yàn)組大鼠8只，分析死因推測(cè)為全身衰竭、打架斗毆、乙醚麻醉過深等。

在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生的過程，某些上皮細(xì)胞在其周圍間質(zhì)的相互作用過程中，逐漸獲得了一些間質(zhì)細(xì)胞的特有性狀。黏附分子波形蛋白、N-鈣黏素是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，他們表達(dá)的增高，標(biāo)志EMT過程的發(fā)生。波形蛋白是細(xì)胞骨架蛋白之一，參與形成細(xì)胞骨架，是中間絲的一種。主要分布在間葉組織細(xì)胞，如肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等，在正常上皮中幾乎不表達(dá)，但在細(xì)胞發(fā)生惡變的情況下，波形蛋白可表達(dá)在上皮源性的腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，賦予了上皮源性細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣的特征，使細(xì)胞更易于遷移和運(yùn)動(dòng)[7-8]。有研究表明，上皮來源的腫瘤如乳腺癌、肝癌、腎上腺癌、胃癌、直腸癌、宮頸癌等，波形蛋白的表達(dá)上調(diào)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及發(fā)生EMT密切相關(guān)[9-10]。張俊君等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在直腸腺癌組織中N-鈣黏素和波形蛋白的表達(dá)明顯高于正常直腸黏膜組織，推斷其高表達(dá)均可提示上皮來源腫瘤發(fā)生EMT，進(jìn)而發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)觀察了4NQO誘導(dǎo)大鼠舌癌變過程中波形蛋白的表達(dá)變化，由于中、重度上皮異常增生樣本量過少，所得數(shù)據(jù)不具有代表性，不能單獨(dú)成為一組，因此在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)將中、重度上皮異常增生歸為一個(gè)組。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，波形蛋白幾乎不表達(dá)于正常上皮組織，而隨著病變程度的增加，蛋白表達(dá)量增加，可在TSCC細(xì)胞中出現(xiàn)陽性表達(dá)，提示了蛋白的表達(dá)量與腫瘤的侵襲密切相關(guān)。RT-PCR結(jié)果表明，各階段病變組織與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，發(fā)現(xiàn)隨著舌黏膜癌變病理分級(jí)的增加，組織中波形蛋白 mRNA的表達(dá)量呈逐漸增加趨勢(shì)，說明波形蛋白參與了舌黏膜癌變的侵襲過程。蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)的一致性，提示了波形蛋白的上調(diào)有可能作為TSCC過程中EMT的有效證據(jù)。Chaw等[12]對(duì)不同病理分級(jí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)波形蛋白隨病變程度的增加而呈上調(diào)趨勢(shì)，波形蛋白mRNA在OSCC中的表達(dá)量是正常中的3.7倍。本實(shí)驗(yàn)與之有相似結(jié)論。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)輕度上皮異常增生、中重度上皮異常增生、TSCC 3個(gè)病理階段互相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這可能與癌變過程時(shí)間短暫，侵襲速度快有關(guān)，也可能與獲得的中重度上皮異常增生組織的樣本量較少密切相關(guān)。有關(guān)口腔癌組織或者細(xì)胞株中波形蛋白的表達(dá)時(shí)有報(bào)道，但癌變過程中病理分級(jí)的研究很少且病理組織很難取得，故本實(shí)驗(yàn)采用大鼠造模，研究癌變過程中的波形蛋白的表達(dá)情況，為探索EMT在口腔鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制及臨床預(yù)防和治療腫瘤提供了新思路。

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Study on the expression of vimentin during the rat tongue carcinogenesis induced by 4NQO*

Deng Tingting,Tan Hong,Mao Liang,Nie Minhai△

(LaboratoryofOralandMaxillofacialReconstructionandRegeneration,InstituteofCardiovascularMedicine/LaboratoryofCardiacElectrophysiology,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression of vimentin in the tongue mucosa carcinogenesis and to explore its significance in the invasion and metastasis of tongue squamous cell carcinoma.MethodsThe occurrence of tongue squamous cell carcinoma in rat was induced by means of 4NQO water solution,and 56 cases in total were collected in the cancerous process,including normal tongue mucosa,epithelial hyperplasia,mild dysplasia,moderate dysplasia,severe dysplasia and the tongue tissue specimen of squamous cell carcinoma.The immunohistochemistry was used to evaluate protein expression and real-time fluorescent quantitative PCR method was used to obtain the expression quantity of mRNA.ResultsIn immunohistochemistry,with the increase of degree of rat tongue mucosa dysplasia,the positive rate of vimentin expression increases obviously.The difference between groups was statistically significant (χ2=10.685,P<0.05).Lesion groups compared with normal group,their mRNA expression differences all hold statistical significance(P<0.05);Mild dysplasia,moderate dysplasia,severe dysplasia and squamous cell carcinoma groups were compared with epithelial hyperplasia group.The difference between squamous cell carcinoma group and epithelial hyperplasia group was statistically significant (P<0.05).mRNA expression of epithelial hyperplasia,mild dysplasia,moderate dysplasia and severe dysplasia were respectively 1.22 times,1.28 times,1.29 times and 1.42 times of that of the normal group.ConclusionDuring rat tongue carcinogenesis induced by 4NQO,the expression of vimentin was increased with the increase of the degree of pathological change,which is closely related to the invasion of tumor and could be regarded as a predictor of tongue squamous cell carcinoma.

[Key words]vimentin;mRNA;tongue squamous cell carcinoma;real-time PCR;4NQO

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.011

*基金項(xiàng)目:瀘州市政府-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合專項(xiàng)資金科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013LZLY-J32);四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2003JY0126)。

作者簡(jiǎn)介:鄧婷婷(1989-)，在讀碩士，主要從事口腔黏膜專業(yè)研究。△通訊作者,Tel:(0830)3109289;E-mail：nieminhai@126.com。

[中圖分類號(hào)]R739.8

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)16-2194-04

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-02-26)