鐘亮尹，劉思敏，曾智華，徐曉松，盧漢威，周文超，黃演婷，盧景輝，陳思聰

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510080)

?

弓形蟲CDPK5基因多克隆抗血清的制備及功能鑒定*

鐘亮尹，劉思敏，曾智華，徐曉松，盧漢威，周文超，黃演婷，盧景輝，陳思聰

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510080)

[摘要]目的篩選弓形蟲(Tg)CDPK5基因序列的免疫多肽，將合成多肽免疫新西蘭白兔制備多抗血清，并對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。方法利用生物信息學(xué)的方法分析確定Tg CDPK5序列免疫多肽，再用合成的多肽免疫新西蘭白兔制備多抗。收集多抗血清，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)定多抗滴度，蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定免疫活性，免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析Tg CDPK5的亞細(xì)胞定位。結(jié)果通過生物信息學(xué)分析，選擇Tg CDPK5序列N端一段長(zhǎng)17 bp的多肽序列作為免疫多肽；用合成的多肽免疫兔子，成功獲得多抗血清。ELISA測(cè)定多抗血清效價(jià)為1∶640 000；Western blot證明該多抗血清能特異性識(shí)別Tg CDPK5(75.4×103)條帶；免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該多抗能特異性識(shí)別弓形蟲內(nèi)源Tg CDPK5蛋白。結(jié)論研究根據(jù)Tg CDPK5序列信息的分析，獲得Tg CDPK5序列免疫多肽，并制備兔源多克隆抗體。

[關(guān)鍵詞]弓形蟲;CDPK5基因;多抗血清;免疫熒光

弓形蟲(toxoplasma gondii,Tg)是一種頂復(fù)門寄生蟲，可感染幾乎所有哺乳動(dòng)物和鳥類，引起人獸共患的弓形蟲病[1]。由于其傳播能力極強(qiáng)，對(duì)畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生安全的危害極大。全世界大約有1/3的人感染Tg[2]，但多數(shù)為隱形感染。在免疫力低下或免疫缺陷患者中，這種潛伏性感染可被激活，進(jìn)而引起嚴(yán)重的損害；孕婦感染Tg可引起流產(chǎn)、死胎或畸形；另外，30%～70%患有先天性弓形蟲病的新生兒會(huì)繼發(fā)視網(wǎng)膜病變[3]。目前，治療弓形蟲病的經(jīng)典藥物仍以乙胺嘧啶聯(lián)合磺胺類藥物為主，但其缺點(diǎn)是療程長(zhǎng)達(dá)1年以上，具有不良反應(yīng)，而且僅對(duì)Tg滋養(yǎng)體有抑制效果，不能治愈弓形蟲病[4]；阿奇霉素是惟一對(duì)包囊和速殖子均有一定作用的藥物，半衰期長(zhǎng)，不良反應(yīng)較少，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性和耐藥性。因此，面對(duì)不斷增長(zhǎng)的Tg感染患者和Tg抗藥性的產(chǎn)生，開發(fā)新的抗Tg藥物不但至關(guān)重要而且面臨著急迫性。

鈣依賴的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase，CDPK)家族是一類鈣離子(Ca2+)結(jié)合的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對(duì)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游元件的調(diào)控具有重要作用。Ca2+作為Tg細(xì)胞內(nèi)多種生理生化過程的重要環(huán)節(jié)，其水平的異常直接導(dǎo)致細(xì)胞功能的異常。研究發(fā)現(xiàn)，Tg CDPKs可參與調(diào)控Tg入侵宿主細(xì)胞、蛋白分泌、運(yùn)動(dòng)，及分化等生理過程[5]。除此之外，一些CDPKs具有良好的免疫原性，不僅能刺激淋巴細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，被認(rèn)為是研發(fā)針對(duì)頂復(fù)門原蟲新型生物制劑的候選基因[6]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，Tg CDPKs基因大約有11個(gè)。已經(jīng)被證實(shí)的有CDPK1、CDPK2、CDPK3及CDPK4[7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Tg CDPK5可能與Tg的細(xì)胞毒力、侵襲力相關(guān)[8]。然而關(guān)于Tg CDPK5對(duì)Tg生長(zhǎng)、毒力、侵襲力、微線體分泌，以及水甘油滲透性的調(diào)控作用報(bào)道較少。為了研究Tg CDPK5對(duì)Tg的生物學(xué)功能，Tg CDPK5蛋白多抗是實(shí)驗(yàn)研究的重要材料之一。本研究擬通過經(jīng)典多抗制備方法獲得兔抗Tg CDPK5多克隆抗體，并通過相應(yīng)檢測(cè)方法，確定該多抗的效價(jià)以及特異性，旨在為Tg CDPK5基因后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1Tg蟲株Tg蟲株為剛地Tg ME49株(Ⅱ型蟲株)，液氮保種，復(fù)蘇后腹腔接種小鼠傳代。

1.1.2主要試劑免疫多肽由廣州瑞博奧生物科技有限公司合成；馬來酰亞胺活化的BSA、KLH偶聯(lián)試劑盒(MBK1)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨、四甲基乙二胺(TEMED)、脫脂奶粉為Sigma公司產(chǎn)品，多聚甲醛，30%丙烯酰胺購自弗德生物，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、購自Roche公司。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自Santa Curz，蛋白質(zhì)Marker購自Fermentas公司；PVDF膜購自BioRad公司，TMB底物顯色液、Alexa Fluor488標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自Invitrogen，蛋白免疫印跡法(Western blot)底物顯色液購自Thermo fisher Scientific，BSA、TritonX-100購自碧云天生物技術(shù)研究所，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1Tg CDPK5免疫多肽的獲得根據(jù)NCBI中TgCDPK5序列(NCBI序列號(hào)：XM_002366128.1)，使用TMHMM軟件和BCPREDS Server 1.0軟件對(duì)TgCDPK5的跨膜區(qū)和B細(xì)胞線性抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。選取具有高度抗原性的非跨膜區(qū)保守序列，并委托廣州瑞博奧生物科技有限公司合成多肽。

1.2.2多克隆抗體的制備與純化合成的多肽用試劑盒偶聯(lián)BSA或KLH。將偶聯(lián)多肽溶于無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，以等體積的比例分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑進(jìn)行充分乳化作為免疫原。將獲得的免疫原免疫新西蘭大白兔(雄性，1.5 kg)。經(jīng)背部皮下多點(diǎn)注射，第3次免疫3 d后，耳緣靜脈取血，測(cè)抗體效價(jià)。待血清效價(jià)達(dá)到一定值后，常規(guī)心臟取血，收集血清于-80 ℃保存?zhèn)溆?。用結(jié)合緩沖液稀釋多抗血清后于0.45 μm濾膜過濾，加樣到IgG親和層析柱，流速1 mL/min至基線，用洗脫緩沖液(100 mmol/L甘氨酸-HCl，pH 2.5)洗脫后，收集洗脫峰為純化的多克隆抗體。取5 μL進(jìn)行十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察純化后結(jié)果。

1.2.3多克隆抗血清效價(jià)鑒定采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)抗血清效價(jià)：每孔100 ng包被原于4 ℃包被過夜，第2天用1%BSA-PBS封閉1 h；洗滌后，加入梯度稀釋的多克隆抗血清孵育2 h，以正常兔血清作為陰性對(duì)照。洗滌后，加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG孵育1 h，TMB顯色。用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)值。

1.2.4多抗血清免疫活性鑒定樣本為1×107數(shù)量的純化的Tg，Tg用人包皮成纖維細(xì)胞(HFF-1)培養(yǎng)，用3 μm濾膜純化。超聲裂解蟲體后，取上清液經(jīng)12%SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，以免疫前正常兔血清為陰性對(duì)照，制備的Tg CDPK5抗血清為一抗，羊抗兔HRP-IgG為二抗，ECL顯色，觀察結(jié)果。

1.2.5免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析Tg CDPK5的亞細(xì)胞定位以免疫前正常兔血清為陰性對(duì)照，取純化的Tg涂于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，室溫晾干。加入4%多聚甲醛固定10 min，PBST洗滌3次，每次5 min。加入0.1%Triton-X-100，透化15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。加入PBS固定30 min后，加入制備的Tg CDPK5抗血清作為一抗1∶100稀釋，孵育1 h。PBS洗滌3次，每次5 min。1∶1 000的比例加入二抗(Alexa Fluor488標(biāo)記的羊抗鼠IgG)，孵育1 h，避光，室溫。PBS洗滌3次。加入DAPI染色10 min，PBST洗滌1次，上機(jī)照相。

2結(jié)果

2.1Tg CDPK5免疫多肽序列分析利用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析Tg CDPK5(GenBank:EPT26997.1)的跨膜區(qū)域，分析結(jié)果顯示該基因無跨膜區(qū)(圖1)。因此在選取多肽制備抗體時(shí)不用避免跨膜區(qū)，可以選擇氨基酸序列N端或C端免疫原性評(píng)分較高的區(qū)域選擇多肽。利用IEDB網(wǎng)站(http://www.iedb.org/)中的Bepipred Linear Epitope Prediction軟件(http://tools.immuneepitope.org/bcell/help/#Bepipred)預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位?；€以上黃色區(qū)域評(píng)分較高的可以作為候選的多肽，見圖2。

圖1　Tg CDPK5的跨膜區(qū)分析

圖2　B細(xì)胞表位分析

序號(hào)起點(diǎn)位置末端位置多肽序列長(zhǎng)度(bp)1622AATKTSPVTAVVPGDSV1723238NGDATGA734459STPRTEKASATRCSTP16467111GRNTDVPEDGKDAAAVGEGNTKRGLDDFDADYGCRGGDCCDTSTK455123139N121EGKDKSQHDRREP176151159MNASEASRW97164200QCNSTCPGDGFDGASGTTAADGI181PASPQPEAPVF378215238QQITDIYDTPNGTSLGKGSYGSVV24

2.2免疫多肽的確定表1列舉了Tg CDPK5序列N端的評(píng)分較高的多肽。按照結(jié)合多肽長(zhǎng)度為15～20 bp較為合適的原則，選擇表格中紅色標(biāo)注的多肽序列進(jìn)行合成，獲得Tg CDPK5免疫多肽。

2.3多克隆抗血清效價(jià)鑒定以純化的Tg CDPK5合成多肽作為抗原包被ELISA反應(yīng)板，已采集的多克隆抗體為一抗，同時(shí)以未免疫的兔血清為陰性對(duì)照，1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，效價(jià)以實(shí)驗(yàn)組的A450(P)/陰性血清對(duì)照組的A450(N)>2.1作為判定陽性的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果顯示多抗血清的效價(jià)為1∶640 000，見圖3。對(duì)該多克隆抗體進(jìn)行親和純化，純化結(jié)果見圖4。

圖3　抗TgCDPK5蛋白多克隆抗血清效價(jià)分析

2.4多抗血清免疫活性鑒定Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以免疫前正常兔血清作為對(duì)照，制備的抗Tg CDPK5抗體能特異性識(shí)別Tg的天然Tg CDPK5蛋白，在約75×103處可見一條特異性條帶，而正常兔血清中未見(圖5)?？梢娍筎g CDPK5血清能特異性識(shí)別Tg CDPK5(75.4×103)條帶。

2.5免疫熒光實(shí)驗(yàn)以免疫前正常兔血清作為陰性對(duì)照，進(jìn)一步的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該多克隆抗體能特異性識(shí)別Tg內(nèi)源Tg CDPK5蛋白。除此之外，通過DAPI核染發(fā)現(xiàn)，該蛋白以可溶的形式存在于蟲體細(xì)胞質(zhì)中。

M:Marker。

圖4Tg CDPK5多抗純化

1：抗血清；2：正常兔血清。

圖5多克隆抗血清對(duì)天然的TgCDPK5蛋白的識(shí)別

綠色熒光：CDPK5；藍(lán)色熒光：細(xì)胞核。

圖6免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Tg CDPK5蛋白細(xì)胞定位

3討論

CDPKs是一類龐大的蛋白激酶家族，屬于絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，廣泛存在于各種植物及原生動(dòng)物中。研究表明，Tg CDPK1能夠有效的調(diào)控Ca2+依賴的胞外分泌，抑制Tg CDPK1的表達(dá)導(dǎo)致Tg運(yùn)動(dòng)性降低、入侵/離開宿主細(xì)胞能力減弱[9]；Tg CDPK3與惡性瘧原蟲CDPK1(PfCDPK1)高度同源(約50%)，對(duì)Tg離開宿主細(xì)胞的過程至關(guān)重要[10-11]。Zhang等[8]將真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-TgCDPK5注射昆明鼠后產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞Th1免疫應(yīng)答并一定程度上提高了感染Tg小鼠的生存時(shí)間，提示TgCDPK5可能與細(xì)胞毒力、侵襲力相關(guān)。本研究所涉及的Tg CDPK5基因(NCBI檢索號(hào)：EPT26997.1)是Tg重要的功能基因，由682個(gè)氨基酸組成，其定位與生物學(xué)功能尚不清楚。關(guān)于Tg CDPK5對(duì)Tg生長(zhǎng)、毒力、侵襲力、微線體分泌，以及水甘油滲透性的調(diào)控作用均未見報(bào)道。

為探究Tg CDPK5編碼蛋白的功能，獲得Tg CDPK5抗體顯得意義重大。本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析獲得Tg CDPK5免疫多肽，成功制備了兔抗Tg CDPK5多克隆抗體。對(duì)于CDPKs在功能方面的研究通常采用生化方法來進(jìn)行，可直接測(cè)定或使用特異性的激活劑來識(shí)別該酶的特異調(diào)節(jié)因子[12]。除此之外，較難通過直接提取和純化的方式獲得該蛋白。雖然體外表達(dá)目的蛋白可以獲得具有天然活性的蛋白激酶，但該方法繁瑣，需較大工作量。本研究通過對(duì)Tg CDPK5的序列信息分析，發(fā)現(xiàn)該基因無跨膜區(qū)，因此可以選擇氨基酸序列N端或C端免疫原性評(píng)分較高的區(qū)域選擇多肽。通過對(duì)Tg CDPK5蛋白的免疫原性分析，本研究選定該序列N端一段長(zhǎng)17 bp的多肽序列進(jìn)行合成，從而獲得制備多抗所需的Tg CDPK5免疫多肽。該方法較之體外表達(dá)目的蛋白的方法更加簡(jiǎn)便直接，可以獲得特異性較強(qiáng)的抗原，為后續(xù)抗體的成功制備奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)不僅制備了能特異性識(shí)別Tg內(nèi)源性Tg CDPK5蛋白的兔抗Tg CDPK5多克隆抗體，還利用該多抗證實(shí)了Tg CDPK5蛋白以可溶形式存在于蟲體細(xì)胞質(zhì)中。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，該抗體將會(huì)發(fā)揮更多使用價(jià)值。了解Tg CDPK5的作用機(jī)制，針對(duì)Tg CDPK5獨(dú)特的生物學(xué)特性進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)，對(duì)治療Tg的藥物研發(fā)具有指導(dǎo)性作用，也對(duì)頂復(fù)門其他原蟲的藥物研究有一定借鑒意義。

參考文獻(xiàn)

[1]Dubey JP,Beattie CP.Toxoplasmosis of animals and man[M].FLA:CRC Press,1998：22-50.

[2]Mercier A,Ajzenberg D,Devillard S,et al.Human impact on genetic diversity of Toxoplasma gondii:example of the anthropized environment from French Guiana[J].Infect Genet Evol,2011,11(6):1378-1387.

[3]Samuel R,Bettiker RL,Sul B.AIDs related opportunistic infections,going but not gone[J].Arch Pharm Res,2002,25(3):215-228.

[4]唐宏霞，熊學(xué)峰，秦志強(qiáng)．乙酰螺旋霉素聯(lián)合阿奇霉素治療孕期弓形蟲感染的臨床效果[J]．中國(guó)血吸蟲病防治雜志，2013，25(5)：555-556．

[5]張念章，陳佳，王萌，等．頂復(fù)門原蟲鈣依賴蛋白激酶的研究進(jìn)展[J]．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44(1)：1-6．

[6]Nagamune K,Sibley LD.Comparative genomic and phylogenetic analyses of Calcium ATPases and calcium-regulated proteins in the apicomplexa[J].Mol Biol Evol,2006,23(8):1613-1627.

[7]Sugi T,Kato K,Kobayashi K,et al.Molecular analyses of Toxoplasma gondii calmodulin-like domain protein kinase isoform 3[J].Parasitol Int,2009,58 (4):416-423.

[8]Zhang NZ,Huang SY,Xu Y,et al.Evaluation of immune responses in mice after DNA immunization with putative Toxoplasma gondii calcium-dependent protein kinase 5[J].Clin Vaccine Immunol,2014,21(7):924-929.

[9]Lourido S,Zhang C,Lopez MS,et al.Optimizing small molecule inhibitors of calcium-dependent protein kinase 1 to prevent infection by Toxoplasma gondii[J].J Med Chem,2013,56(7):3068-3077.

[10]Choi KM,Kim JY,Moon SU,et al.Molecular cloning of Plasmodium vivax calcium-dependent protein kinase 4[J].Korean J Parasitol,2010,48(4):319-324.

[11]孔春林，韓紅玉，李洋，等．柔嫩艾美耳球蟲鈣依賴蛋白激酶3基因在畢赤酵母中的表達(dá)及分析[J]．生物技術(shù)通報(bào)，2012(4)：108-112．

[12]Kieschnick H,Wakefield T,Narducci CA,et al.Toxoplasma gondii attachment to host cells is regulated by a calmodulin-like domain protein kinase[J].J Biol Chem,2001,276(15):12369-12377.

Preparation of the polyclonal antibodies of CDPK5 gene from toxoplasma gondii and the identification of its functions*

Zhong Liangyin,Liu Simin,Zeng Zhihua,Xu Xiaosong,Lu Hanwei,Zhou Wenchao,Huang Yanting,Lu Jinghui,Chen Sicong

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofGuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong510080,China)

[Abstract]ObjectiveScreening the immune polypeptide sequence of toxoplasma (Tg) CDPK5 gene,which were synthesized and then immunized the New Zealand white rabbit to prepare antiserum,and identification its function.MethodsBioinformatics analysis was used to determine the immune peptide of Tg CDPK5 sequence,which were artificially synthesized to immune white rabbit to prepare antiserum.The titers of antibodies were determined by ELISA and the polyclonal antibodies were verified with CDKP5 antigen by Western blot.The sub-cellular localization of Tg CDPK5 were obtained by immunofluorescence assay.Results17 bp peptide sequence from the Tg CDPK5 N-terminal were chosen as immune polypeptide by bioinformatics analysis.Synthetic peptide were used to immune rabbit to obtain polyclonal antiserum.The result showed that the titer of the obtained ployantibody were 1∶640 000;Western blot demonstrated that the antiserum could specifically recognize Tg CDPK5(75.4×103);Immunofluorescence assay revealed this antibody could specifically recognize the endogenous Tg CDPK5 of Toxoplasma gondii.ConclusionAccording to the analysis of Tg CDPK5 sequence information,this study successful obtained Tg CDPK5 polyclonal antibody.

[Key words]toxoplasma gondii;CDPK5 gene;antiserum;immunofluorescence assy

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.008

*基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目(2015120124650789)。

作者簡(jiǎn)介：鐘亮尹(1966-)，副主任技師，本科，主要從事臨床免疫學(xué)研究。

[中圖分類號(hào)]R392.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)16-2182-04

(收稿日期：2016-01-08修回日期：2016-03-28)