李　冬，田　寅，宮　宇，王　曦

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.藥劑科；2.腫瘤外科,黑龍江佳木斯 154007)

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阿爾茨海默病大鼠模型建立及葛根素對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響*

李冬1，田寅2△，宮宇1，王曦1

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.藥劑科；2.腫瘤外科,黑龍江佳木斯 154007)

[摘要]目的探討葛根素對β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的影響。方法采用雙側(cè)海馬注射Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型。造模后3 d起，葛根素按不同劑量灌胃給藥28 d，給藥結(jié)束后采用Morris水迷宮測試系統(tǒng)，檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶能力障礙，而葛根素高、中、低劑量組干預(yù)則顯著地改善了AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)論葛根素能部分的提高AD模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默??；葛根素；空間學(xué)習(xí)記憶

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種起病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的不可逆轉(zhuǎn)、漸進(jìn)性的認(rèn)知功能障礙和精神異常[1-2]。AD發(fā)病初期，會(huì)出現(xiàn)近期記憶出現(xiàn)缺失，保存遠(yuǎn)期的記憶和高級學(xué)習(xí)記憶[3-4]。之后，記憶缺失進(jìn)展為遠(yuǎn)期記憶及其他認(rèn)知和行為功能缺失，認(rèn)知功能下降、進(jìn)行技巧工作及理解力損害、語言和視空間反常，計(jì)算能力下降[5-7]。本研究以逃避潛伏期和過臺次數(shù)為指標(biāo)，通過Morris水迷宮檢測葛根素對AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響，為AD的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組將成年健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)分為6組，即假手術(shù)組、模型對照組、鹽酸多奈哌齊對照組、葛根素低劑量組、葛根素中劑量組、葛根素高劑量組，每組各10只。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器腦立體定位儀(江灣一型C，第二軍醫(yī)大學(xué))；微量進(jìn)樣器(上海精密激光儀器廠)；電子天平(AE-240型，梅特勒-托利多儀器有限公司)；超低溫冰箱(MDF-492，日本三洋公司)；電冰箱(BCD-243型，中國康拜恩電冰箱總廠)；壓力蒸汽滅菌器(ZDX-35SB，上海申安醫(yī)療器械廠)； PURELAB PLUS超純水系統(tǒng)(美國波爾公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101-1AB，天津泰思特儀器有限公司)。

1.1.3藥品及試劑葛根素純粉劑(南京正大天晴制藥有限公司)；鹽酸多諾哌齊片(貴州圣濟(jì)堂制藥)；Aβ1-42(Sigma公司)；無水乙醇注射液(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)。

1.2方法

1.2.1AD大鼠模型的建立[8]大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，術(shù)前12 h禁食不禁水，進(jìn)行造模。SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉后，固定于江灣Ⅰ型C大鼠立體定位儀，顱頂區(qū)備皮，消毒，沿頭頂中線部位作約2 cm的切口，將骨膜分離使其頭骨暴露，從前鹵向后約3.0 mm，從中線左、右兩旁開2.0 mm處，將用牙科鉆打開顱骨。用微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針2.8 mm，將10 μg/μL β-淀粉樣蛋白Ⅰ(Aβ1-42)溶液在5 min內(nèi)緩慢注入，留針5 min后緩慢撤針，再用牙科泥封堵住顱骨，消毒并縫合皮膚。假手術(shù)組注射與1 μL 0.9%生理鹽水注射液，其余操作同前。以假手術(shù)組平均逃避潛伏期作為參考值，用每支大鼠的逃避潛伏期與參考值只差占該大鼠的逃避潛伏期的比值來判定判定AD大鼠模型的建立是否成功，該比值大于20認(rèn)為造模成功，造模不成功的大鼠不列入數(shù)據(jù)計(jì)算。

1.2.2動(dòng)物給藥治療動(dòng)物造模3 d后開始灌胃給藥治療。葛根素低、中、高劑量組分別按25、50、100 mg/kg給藥，鹽酸多奈哌齊對照組用鹽酸多奈哌齊溶液灌胃治療(按0.33 mg/kg給藥)，假手術(shù)組與模型對照組用相同體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃治療，共給藥28 d。

1.2.3Morris水迷宮測試[9]預(yù)先在水池里注入清水，水溫控制在26 ℃左右，加入奶粉使其成為不透明的乳白色水溶液，再將適量的清水注入，使水面略高于平臺，水深在30 cm左右。實(shí)驗(yàn)開始前1 d將大鼠分別放入沒有平臺的水迷宮內(nèi)，每只鼠

表1　定位航行實(shí)驗(yàn)各組大鼠平均逃避潛伏期±s，s)

*：P<0.05，與模型組比較。

自由游泳2 min，使其適應(yīng)游泳環(huán)境，將大鼠頭部染成黑色。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)7 d，每次訓(xùn)練限時(shí)1 min。測試開始時(shí)沿水池中部的池壁將大鼠緩慢的放入池中，大鼠需面對池壁入水。記錄大鼠從入水點(diǎn)入水后在1 min內(nèi)找到平臺的時(shí)間，若大鼠在1 min內(nèi)沒能找到平臺，就人工把大鼠置于平臺上并使其在上面停留30 s，結(jié)束1次訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)過程中水池周圍的參照物位置保持不變。連續(xù)實(shí)驗(yàn)6 d，實(shí)驗(yàn)的第7天，撤掉安全平臺開始測試大鼠對平臺空間位置記憶的能力。與前6 d測試步驟相同，記錄大鼠尋找記憶中的平臺所花費(fèi)的時(shí)間。將大鼠第1次經(jīng)過平臺的時(shí)間(潛伏期)和每只大鼠在1 min內(nèi)經(jīng)過平臺的次數(shù)分別記錄。

2結(jié)果

2.1定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在6 d的實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠的平均逃避潛伏期總體呈下降趨勢，說明大鼠經(jīng)過多次訓(xùn)練，對平臺的記憶能力增加，但是各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所不同。采用重復(fù)測量多因素方差分析結(jié)果顯示：在不同時(shí)間大鼠逃避潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(5，105)=141.225，P<0.05]，以時(shí)間為主效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(25，525)=3 921.016，P<0.05]。各時(shí)間點(diǎn)和不同組別之間存在交互效應(yīng)[F(30，535)=12.806，P<0.05]。表明模型組大鼠學(xué)習(xí)獲取能力較差，而葛根素能改善模型大鼠的學(xué)習(xí)障礙。比較不同時(shí)間段各指數(shù)之間的差異，第1天各組大鼠逃避潛伏期無明顯差異，第2～6天，模型組大鼠平均逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P<0.05)；葛根素組和鹽酸多奈哌齊組大鼠平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05)，見表1。

2.2空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果在空間探索實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，模型組跨越原平臺的次數(shù)明顯減少，而葛根素低劑量、中劑量、高劑量組大鼠跨越原平臺的次數(shù)明顯增多。鹽酸多奈哌齊與葛根素效應(yīng)相當(dāng)，見表2。

表2　各組大鼠跨越原平臺的次數(shù)比較±s)

*：P<0.05，與模型組比較。

3討論

迷宮是檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的裝置，本研究先對動(dòng)物進(jìn)行某種訓(xùn)練，經(jīng)過一定的時(shí)間后，測其保存量以衡量其記憶。游出時(shí)間及錯(cuò)誤次數(shù)反映了動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過反復(fù)訓(xùn)練動(dòng)物，同時(shí)記錄動(dòng)物尋找平臺的時(shí)間來評價(jià)其學(xué)習(xí)能力，動(dòng)物尋找平臺的時(shí)間越短，說明動(dòng)物學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。撤掉平臺后，通過檢測動(dòng)物經(jīng)過原平臺所在位置的次數(shù)來評價(jià)動(dòng)物對于訓(xùn)練的記憶能力。給藥結(jié)束后，將6組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別進(jìn)行訓(xùn)練和測試，增加訓(xùn)練的次數(shù)，各組平均尋找平臺的時(shí)間呈逐漸縮短趨勢。這表明大鼠通過多次訓(xùn)練，尋找平臺的能力增加。但Aβ1-42注射所致AD大鼠模型組學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于假手術(shù)組，表明腦內(nèi)注射Aβ1-42制備的動(dòng)物模型記憶能力明顯的下降，動(dòng)物具有類似“癡呆”表現(xiàn)，表明AD模型制備成功。而葛根素組與多奈哌齊組的潛伏期明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明葛根素和多奈哌齊對Aβ1-42誘導(dǎo)的AD大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶缺失具有明顯的改善功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，葛根素組對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用與假手術(shù)組相比還具有一定的差距，表明葛根素只能部分的提高AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，卻不能徹底的治愈。

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The construction of Alzheimer′s disease rats model and the effects of puerarin on rat spatial learning and memory*

Li Dong1,Tian Yin1△,Gong Yu2,Wang Xi1

(1.DepartmentofPharmacy;2.DepartmentofSurgicalOncology,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi,Heilongjiang154002,China)

[Abstract]ObjectiveTo research the effects of puerarin on Alzheimer′s disease(AD) rats spatial learning and memory disorder induced by Aβ1-42.MethodsBilateral hippocampal injection of Aβ1-42 was used to induced AD model rats.All rats underwent gavage administration with puerarin with different dose for 28 d since the 3rd day after the construction of model;and the Morris water maze was used to test the spatial learning and memory ability of rats.ResultsThe model group rats showed obvious learning and memory disorder,and the ability of learning and memory disorder of rats in the high,medium and low dose of puerarin intervention group were significantly improved.ConclusionPuerarin can improve the spatial learning and memory ability of AD model rats.

[Key words]Alzheimer disease;puerarin;spatial learning and memory

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.007

*基金項(xiàng)目：佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)目(Sq2013-021)。

作者簡介：李冬(1982-)，主管藥師,碩士，主要從事臨床藥學(xué)、天然藥化研究。△通訊作者,Tel:15694549965；E-mail:dongdong_3333@163.com。

[中圖分類號]R965.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)16-2180-02

(收稿日期：2015-12-25修回日期：2016-03-01)