張健民,陳　鵬,張凡喜,黃曉龍,周玉峰

(中國人民解放軍第三二四醫(yī)院神經(jīng)外科,重慶 400020)

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血管緊張素1-7對蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障通透性的保護(hù)作用*

張健民,陳鵬,張凡喜△,黃曉龍,周玉峰

(中國人民解放軍第三二四醫(yī)院神經(jīng)外科,重慶 400020)

[摘要]目的分析血管緊張素Ang-(1-7)對蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后血腦屏障通透性的作用及機(jī)制。方法枕大池二次注血法制備SAH大鼠，伊文思藍(lán)(Evans blue)檢測Ang-(1-7)處理后SAH大鼠血腦屏障通透性及腦組織含水量；實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)與蛋白免疫印跡法(Western blot)分析腦組織黏連蛋白ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)。人工血性腦脊液(BCSF)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)，檢測細(xì)胞通透性及細(xì)胞增殖與凋亡情況。結(jié)果Ang-(1-7)可降低SAH大鼠腦組織中Evans blue滲透量及腦組織含水量，具有劑量和時間依賴性，以10-5mol/L Ang-(1-7)處理24 h時變化最為顯著，SAH大鼠腦組織中ICAM-1、VCAM-1表達(dá)水平顯著上調(diào)。同時Ang-(1-7)作用的BCSF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Evans blue的滲透量明顯減少，ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)水平及細(xì)胞增殖活力顯著增加，細(xì)胞凋亡減少。結(jié)論Ang-(1-7)具有保護(hù)蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障通透性作用。

[關(guān)鍵詞]蛛網(wǎng)膜下腔出血;血腦屏障通透性;Ang-(1-7);血管內(nèi)皮細(xì)胞

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是由動脈硬化等多種病因引起的腦部血管病變過程，具有極高的致死、致殘率[1]。其發(fā)病機(jī)制與血腦屏障通透性的改變有關(guān)，后者則受血管內(nèi)皮細(xì)胞、黏連蛋白等多種因素綜合調(diào)控[2-3]。血管緊張素1-7[Ang-(1-7)]是由AngⅠ或Ⅱ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶作用下產(chǎn)生的活性物質(zhì)，能改善腦部氧化應(yīng)激及神經(jīng)功能狀況，降低腦梗死風(fēng)險(xiǎn)，對心血管及腦部組織病變具有保護(hù)作用[4]。本文以SAH小鼠模型為對象，分析了Ang-(1-7)對SAH后血腦屏障通透性及黏連蛋白ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響，并以人工血性腦脊液體外模擬SAH過程，分析Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活性的影響，探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料雄性SD級大鼠60只(平均體質(zhì)量280～320 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)；實(shí)時熒光定量PCR(RT-PCR)儀(Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson公司)；Ang-(1-7) (Sigma公司)；伊文思藍(lán)(Evans,blue,Sigma公司)；人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；ICAM-1、VCAM-1、β-actin抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔二抗(北京鼎國公司)；總RNA提取試劑盒(Tiangen公司)；RT-PCR MasterMix kit(Toyobo公司)；ICAM-1、VCAM-1、GAPDH引物(Takara公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1SAH動物模型制備及分組SD大鼠分為假手術(shù)組(6只)、模型對照組(6只)、實(shí)驗(yàn)組(48只)。參照Müller等[3]方法用枕大池二次注血法制備SAH大鼠。SD大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉，注射器針頭經(jīng)環(huán)枕筋膜刺入枕大池中，抽出0.4 mL/kg腦脊液，將0.8 mL/kg耳中央動脈血緩慢注入枕大池蛛網(wǎng)膜下腔中。手術(shù)48 h后，同樣方法二次注入0.4 mL/kg動脈血。假手術(shù)組注入等量生理鹽水。模型制備24 h后，用微型真空泵在大鼠側(cè)腦室植入導(dǎo)管，緩慢注入含不同濃度Ang-(1-7)(10-7、10-6、10-5、10-4、10-3mol/L)腦脊液，每種濃度設(shè)6個重復(fù)，24 h后進(jìn)行Evans blue及腦水腫檢測。同時對10-5mol/L Ang-(1-7)處理6、12、24、48 h后的SAH大鼠進(jìn)行檢測。設(shè)未經(jīng)Ang-(1-7)處理的SAH大鼠為對照組。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理參照陳志等[5]方法，按正常人血液與人工腦脊液1∶1比例混合配制血性腦脊液(BCSF)，離心后取上清液與DMEM培養(yǎng)基2∶1比例混合待用。HBMEC細(xì)胞分為對照組、BCSF刺激組和Ang-(1-7)處理組。各組處理24 h后用于相關(guān)檢測。

1.2.3Evans blue檢測大鼠靜脈注射100 μL Evans blue染液(2%，4 mL/kg)，循環(huán)3 h，過量麻醉處死，自右心室注入50 mL生理鹽水沖洗血管，取出腦組織標(biāo)本，稱質(zhì)量，取一定量組織切塊，按1∶9比例4 ℃過夜浸泡于50%三氯乙酸中。勻漿后4 000 r/min離心30 min，收集上清液于620 nm下測Evans blue吸光值，根據(jù)Evans blue標(biāo)準(zhǔn)溶液(0～6.25 μg/mL)繪制Evans blue吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出腦組織中Evans blue水平。

1.2.4腦組織含水量檢測大鼠過量麻醉處死，迅速取出其腦組織稱質(zhì)量，并于100 ℃烘箱焙干48 h后再稱質(zhì)量，腦組織含水百分比=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.2.5RT-PCR檢測取大鼠腦組織于離心管中，提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參，依據(jù)2-ΔΔCT法計(jì)算各組mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.6Western blot檢測SDS裂解法提取大鼠腦組織總蛋白，煮沸5 min后，取80 μg上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜。3%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，TBST洗膜3次。加入二抗HRP-IgG(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色液曝光顯影。

1.2.7細(xì)胞增殖檢測細(xì)胞接種于96孔板中，分別于37 ℃恒溫培養(yǎng)6、12、24、48 h，用MTT細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒法，490 nm波長下測細(xì)胞光密度(OD)值，判斷細(xì)胞增殖情況。

1.2.8細(xì)胞凋亡檢測收集并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cell/mL，加入終濃度為0.5 μg/mL 的Annexin V-FITC和0.6 μg/mL的PI，避光孵育15 min后，流式細(xì)胞儀分析。

2結(jié)果

2.1Ang-(1-7)減緩SAH大鼠血腦屏障通透性的改變隨Ang-(1-7)水平增加，SAH大鼠腦組織Evans blue滲透量及含水量逐漸降低，至10-6mol/L時出現(xiàn)顯著變化，10-5mol/L時達(dá)到最低(P<0.05)，且隨濃度增加保持不變(圖1A、B)。10-5mol/L Ang-(1-7)處理時，腦組織Evans blue滲透量隨處理時間不同差異明顯，以處理24 h的變化最為顯著(P<0.05)，隨作用時間增加保持不變(圖1C)。

A：不同濃度Ang-(1-7)處理后SAH大鼠腦組織Evans blue滲透量；B：不同濃度Ang-(1-7)處理后SAH大鼠腦組織含水量;C：10-5mol/L Ang-(1-7)處理不同時間后SAH大鼠腦組織Evans blue滲透量。

圖1Ang-(1-7)對SAH大鼠腦組織中Evans blue和腦組織含水量的影響

2.2Ang-(1-7)對SAH大鼠腦組織中ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響10-5mol/L Ang-(1-7)處理24 h后，SAH大鼠腦組織中黏連蛋白ICAM-1、VCAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A、B：ICAM-1和VCAM-1的mRNA及蛋白水平。

圖2Ang-(1-7)對SAH大鼠腦組織中ICAM-1和

VCAM-1表達(dá)的影響

A：HBMEC中Evans blue水平；B、C:HBMEC中ICAM-1和VCAM-1的mRNA及蛋白水平。

圖3Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞中Evans blue及

ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響

2.3Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性及ICAM-1、VCAM-1表達(dá)的影響B(tài)CSF刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞中Evans blue水平較對照組明顯增高，ICAM-1、VCAM-1表達(dá)水平則顯著降低。10-5mol/L Ang-(1-7)處理24 h后，細(xì)胞中Evans blue水平明顯減少，而ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)水平則顯著增加(P<0.05)，見圖3。

2.4Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力的影響10-5mol/L Ang-(1-7)處理24 h后，內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響10-5mol/L Ang-(1-7)處理24 h后，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平顯著下降(P<0.05)，見圖5。

圖4　Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力的影響

A、B：細(xì)胞凋亡水平及定量。

圖5Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

3討論

血腦屏障結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，血流中的蛋白等物質(zhì)會滲透進(jìn)入腦部組織中，引起腦水腫等繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生[6]。已有研究表明，SAH會誘發(fā)急性腦血管痙攣及腦組織缺血癥狀，引起胞內(nèi)黏連蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)水平的下調(diào)，Akt/FOXO信號通路的失活，進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障通透性發(fā)生改變[7]。血腦屏障由血管內(nèi)皮細(xì)胞及多種細(xì)胞和黏連蛋白構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)完整性與內(nèi)皮細(xì)胞的功能活性密切相關(guān)[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是SAH引發(fā)血腦屏障損傷的重要原因。本文通過構(gòu)建大鼠SAH模型，證實(shí)了SAH會導(dǎo)致動物腦部血腦屏障受損及腦水腫的出現(xiàn)。體外實(shí)驗(yàn)表明，人工血性腦脊液能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加、增殖活力減弱、凋亡增強(qiáng)。

Ang-(1-7)是由AngⅠ或Ⅱ在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE2作用下產(chǎn)生的活性物質(zhì)，能與特異性受體Mas結(jié)合，形成ACE2-Ang-(1-7)-Mas反應(yīng)通路，在體內(nèi)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持方面發(fā)揮重要作用[9]。Ang-(1-7)能改善腦部氧化應(yīng)激及神經(jīng)功能狀況，降低腦梗死風(fēng)險(xiǎn)，對心血管及腦部組織病變具有保護(hù)作用。Lu等[10]發(fā)現(xiàn)，在急性腦缺血損傷小鼠模型中，ACE2-Ang-(1-7)-Mas反應(yīng)通路被上調(diào)激活，證實(shí)了該通路對于急性腦損傷具有重要保護(hù)作用。Jiang等[11]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在腦損傷小鼠模型中，Ang-(1-7)能特異性調(diào)節(jié)Mas/eNOS信號通路，促使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖，進(jìn)而促進(jìn)腦血管再生，提高小鼠對腦缺血損傷的耐受能力。Wu等[12]也發(fā)現(xiàn)，外源性Ang-(1-7)可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中TIMP-1/MMP-9表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)胞內(nèi)黏連蛋白Claudin-5和ZO-1的表達(dá)，提升內(nèi)皮細(xì)胞張力，對缺血再灌注引起的血腦屏障損傷發(fā)揮保護(hù)性作用。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源性Ang-(1-7)可以劑量和時間依賴性方式降低SAH大鼠腦組織中Evans blue水平及腦組織含水量，上調(diào)黏連蛋白ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)水平，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖凋亡活力，對SAH引起的血腦屏障損傷和腦水腫具有改善作用。

綜上所述，本文以SAH小鼠模型為對象，證實(shí)了外源性Ang-(1-7)對于SAH引起的血腦屏障損傷和腦水腫具有改善作用，這一過程可能與Ang-(1-7)對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活性的調(diào)控有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為治療因SAH所引發(fā)的腦部病變提供了參考。

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Protective effect of Ang-(1-7) on the permeability of blood brain barrier after subarachnoid hemorrhage*

Zhang Jianmin,Chen Peng,Zhang Fanxi△,Huang Xiaolong,Zhou Yufeng

(DepartmentofNeurosurgery,theNO.324HospitalofPeople′sLiberationArmy,Chongqing400020,China)

[Abstract]ObjectiveTo analysis the effects of Ang-(1-7) on the blood brain barrier permeability after subarachnoid hemorrhage.MethodsSAH-rats were produced by two times injection of blood into cisterna magna.Evans blue was used to detect the the permeability of SAH-rats brains and brain water content.RT-PCR and Western blot were performed to measure the expression of adhesion protein ICAM-1 and VCAM-1 in brains of SAH-rats.The artificial hemorrhagic cerebrospinal fluid (BCSF) was used to stimulate vascular endothelial cells (HBMEC),and the proliferation and apoptosis of HBMEC cell were analyzed.ResultsAng-(1-7) reduced the content of Evans blue and brain water in brains of SAH-rats in dose and time dependent manner with the most significant change under the treatment of 10-5mol/L Ang-(1-7) for 24 h (P<0.05).Under the above condition,the mRNA and protein levels of ICAM-1 and VCAM-1 in brains of SAH-rats were significantly up-regulated (P<0.05),while the content of Evans blue in HBMEC cells stimulated by BCSF was obviously reduced.Besides,Ang-(1-7) was observed to increase the expression of ICAM-1 and VCAM-1 in BCSF-stimulated HBMEC cells,enhance the proliferation of HBMEC cells but reduce their apoptosis.ConclusionAng-(1-7) plays a protective role in the blood-brain barrier damage induced by subarachnoid hemorrhage.

[Key words]subarachnoid hemorrhage;blood-brain barrier permeability;Ang-(1-7);vascular endothelial cell

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.007

*基金項(xiàng)目：國家科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(2013GS500101-15)；中國人民解放軍神經(jīng)創(chuàng)傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2013開放課題資助項(xiàng)目(NTP2013005)。

作者簡介：張健民(1976-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事腦外科工作?！魍ㄓ嵶髡撸琓el:(023)68762064;E-mail:youhua_huang@163.com。

[中圖分類號]R363.1

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2327-03

(收稿日期：2015-12-18修回日期：2016-03-06)