方純嬌，韓 雪，史冬燕，楚德昌

(菏澤學院生命科學系，山東菏澤 274015)

?

牡丹葉片氣孔觀察方法的比較研究

方純嬌，韓 雪，史冬燕*，楚德昌

(菏澤學院生命科學系，山東菏澤 274015)

摘要[目的]用5種不同方法制取牡丹葉下表皮制片并對其氣孔進行比較研究。[方法]采用直接撕皮法、撕皮-刮去葉肉細胞法、NaOH離析法、過氧化氫-冰醋酸離析法和煮沸撕取法制取牡丹葉下表皮，對其制片指標進行了比較，并篩選出最佳染色劑。 [結果] 撕皮-刮去法和過氧化氫-冰醋酸離析法的制片效果較好，葉肉殘留少、真實性強。0.5%的I-KI染液染色效果好。[結論]該研究結果可為今后不同品種牡丹葉表皮的微形態(tài)特征研究奠定基礎。

關鍵詞牡丹；氣孔；觀察方法；氣孔密度

氣孔是調節(jié)植物多種生理功能的重要器官，對植物的光合、呼吸、蒸騰等生理活動起著重要的調節(jié)作用[1]。植物葉片氣孔的密度、大小、分布及運動規(guī)律對研究植物的適應性和抗逆性有重要作用[2]。許多學者對植物葉表皮氣孔的顯微特征研究發(fā)現(xiàn)葉表皮氣孔形態(tài)在植物種質資源多樣性、植物遺傳變異、分類學及植物與其地理環(huán)境的關系方面有著重要意義[3-8]。

牡丹(Paeoniasuffruticosa)為芍藥科芍藥屬植物的多年生落葉小灌木，素有“花中之王”的美譽。牡丹不僅有觀賞價值，而且具有食用和藥用價值。目前對牡丹的研究大多集中在葉片的解剖學結構[9]、光合性特征[10]、愈傷組織誘導[11]以及原生質體分離條件[12]等方面，但有關牡丹葉表皮獲取方法研究則鮮見報道。筆者采用5種不同方法制取牡丹葉下表皮制片，并對其氣孔進行比較研究，探索一種耗時短、操作簡單、結果真實性強的牡丹葉下表皮制片方法，以期為今后不同品種牡丹葉表皮的微形態(tài)特征研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料牡丹葉片于2014年采自菏澤學院生物園。

1.2制片方法

1.2.1直接撕皮法。用鑷子直接撕取葉片中部的下表皮(避開主要葉脈)，在載玻片上滴2滴蒸餾水，用毛筆將表皮展平，蓋上蓋玻片，壓平后進行鏡檢。

1.2.2撕皮-刮去葉肉細胞法。將鑷子撕取的葉下表皮置于帶蒸餾水的載玻片上，用手術刀輕輕刮去殘余葉肉細胞，再制片并觀察。

1.2.3煮沸撕取法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片，洗凈后選葉片中間部分連同葉脈剪成數(shù)段，每段約2 cm×2 cm。將處理好的牡丹葉片放入沸水中直至葉片變成深綠色，避開葉脈撕取葉下表皮，制片并觀察。

1.2.4NaOH離析法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片，洗凈后選葉片中間部分連同葉脈剪成數(shù)段，面積約為2 cm×2 cm。將處理好的葉片用5%NaOH浸泡處理7～8 h，用清水漂洗干凈后，用鑷子撕取葉脈外的葉下表皮制片觀察。

1.2.5過氧化氫-冰醋酸離析法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片用H2O2-HAC(1∶1)離析液浸泡解離9～10 h，取出后用清水漂洗干凈撕取葉下表皮，制片并觀察。

1.3染色液的處理 將撕取的葉下表皮在載玻片上展平后分別用0.5%的I-KI染液、0.5%番紅染液和1%番紅染液染色3～5 min，壓平后迅速進行鏡檢并拍照。

1.4氣孔形態(tài)的比較觀察 每個樣品隨機選20個視野，于40倍物鏡下測量氣孔器的長軸和短軸。每個樣品隨機取30個視野，計算每個視野內的氣孔數(shù)，除以視野面積，計算氣孔密度(個/mm2)。利用數(shù)碼顯微鏡攝像系統(tǒng)(Olympus BX53)，圖像處理系統(tǒng)使用Cellsens Standard軟件測量，用Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。

2結果與分析

2.15種獲取方法的制片指標比較從表1和圖1可以看出，直接撕皮法和撕皮-刮去法制片時間短，需要1～2 min；其次是煮沸撕取法；但是， NaOH離析法、H2O2-HAC離析法需要8～10 h。撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法殘留葉肉細胞最少，清晰度最高；其次是直接撕皮法。從取樣能力和定位性來看，煮沸撕取法、NaOH離析法和H2O2-HAC離析法較好，基本可以在全葉面任一部位取樣；直接撕皮法和撕皮-刮去法取樣能力和定位性差，取樣面積也相對較小。

表1　不同下表皮獲取方法的制片結果比較

注：“-”表示無殘物；“+”表示有少量殘物；“++”表示有較多殘物；“+++”表示有大量殘物。

Note：“-”:no residue; “+”:few residue; “++”:more residue; “+++”:a lot of residue.

注：A.直接撕皮法；B.撕皮刮去法；C.煮沸撕取法；D.NaOH離析法；E.H2O2-HAC離析法。Note：A. Direct tearing method; B. Tearing-scraping method; C. Boiling tearing method; D. NaOH isolation method; E. H2O2-HAC isolation method.圖1　不同方法獲得的牡丹葉下表皮壓片的觀察(400×)Fig.1　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different methods(400×)

2.2不同染色劑對制片效果的影響從圖2可以看出，0.5%I-KI染液染色效果最好，可以清楚看到表皮細胞的形態(tài)、氣孔器的結構和保衛(wèi)細胞內部分內含物質，細胞界線清晰，制片清晰程度高。0.5%番紅染液處理氣孔器的結構和表皮細胞也能看出，但染色的均勻度不好。1%番紅染液的染色效果不理想，只能反映出氣孔器的大概輪廓及開閉狀態(tài)，表皮細胞形態(tài)模糊。

注：A.0.5%I-KI染液；B.0.5%番紅染液；C.1%番紅染液。Note：A. 0.5%I-KI staining; B. 0.5% A red dye;C. 1% A red dye.圖2　不同染色劑獲得的牡丹葉下表皮壓片觀察(400×)Fig.2　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different staining methods

2.3撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法的氣孔真實度比較從表2可以看出，撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法對2種牡丹進行試驗，所測得的氣孔器長軸、短軸及氣孔密度無顯著差異。從氣孔器長軸和短軸長度來看，H2O2-HAC離析法測定值比撕皮-刮去法的測定值偏大。通過氣孔器大小和氣孔密度的測定結果可以看出，2種方法獲得的葉表皮制片的真實性都較高。

表2　撕皮-刮去法和冰醋酸離析法的氣孔形態(tài)比較

3結論

通過對5種不同方法的比較，直接撕皮法和撕皮-刮去葉肉細胞法制取下表皮是隨機的，其取樣能力和定位性能較差，但制片清晰度較高，操作簡單、真實性強等優(yōu)點，使用于葉脈少，葉肉與表皮易于分離的牡丹品種。煮沸撕取法、NaOH離析法和H2O2-HAC離析法3種方法而言，定位性能強，所需儀器設備少，但煮沸撕取法和NaOH離析法葉肉細胞殘留較多，影響試驗結果的觀察。H2O2-HAC離析法耗時較長，但不受材料的限制，且葉肉殘留少、真實性強，可以大批量處理試驗材料，此方法不僅可用于氣孔形態(tài)、開關狀態(tài)和分布狀況等定性指標測定，還可以進行氣孔形態(tài)學指標的定量研究。不同染色劑對制片的影響結果來看，0.5%I-KI染色效果最好，氣孔器和表皮細胞的形態(tài)清晰、界線明顯。因此，選擇有效、適應性廣的牡丹葉下表皮氣孔觀察方法，為進一步研究不同牡丹品種氣孔形態(tài)學和抗逆生理的研究具有重要的輔助作用。

參考文獻

[1] 馬丁.氣孔[M].張崇浩，譯.北京：科學出版社，1987.

[2] 李赟，石蔭坪，束懷瑞，等.應用氣孔性狀對蘋果與梨的倍性判別分析[J].果樹科學，1999，16(1)：9-13.

[3] 謝果珍，舒少華，王沫，等.不同居群括樓葉表皮氣孔形態(tài)研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(12)：2956-2958.

[4] 齊向英，齊龍，趙鵬飛，等.12個棗樹品種葉片氣孔性狀研究[J].江蘇農業(yè)科學，2009(3)：199-200.

[5] 張菊平，周快索，鞏振輝，等.用氣孔保衛(wèi)細胞周長鑒定辣椒植株的倍性[J].西北農業(yè)學報，2007，16(2)：133-135，141.

[6] 徐迎碧，丁之恩，鞏如英，等.4個石榴品種葉表皮特征電鏡掃描分析[J].安徽農業(yè)科學，2008，36(27)：11709-11711.

[7] 魯法軍，朱立濤，侯元同，等.中國寥屬篇蓄組植物葉下表皮微形態(tài)研究[J].西北植物學報，2007，27(3)：464-468.

[8] 陳雪華，鄧穗生.番荔枝屬不同品種葉表面微形態(tài)的電鏡觀察[J].電子顯微學報，2006，25(2)：162-167.

[9] 孫會忠，侯小改，劉改秀，等.5種野生牡丹葉片的解剖學特征[J].福建農林大學學報，2012，41(1)：24-28.

[10] 呂淑芳，孔祥生，王征宏，等.不同牡丹品種葉片光合特性研究[J].河南農業(yè)科學，2009(2)：87-89.

[11] 齊向英，陳宗禮，薛浩，等.矮牡丹葉片愈傷組織誘導研究[J].江蘇農業(yè)科學，2012，40(1)：48-49.

[12] 于相麗，李勇慧，李業(yè)，等.牡丹葉片原生質體分離條件的研究[J].河南農業(yè)科學，2012，41(1)：122-125.

基金項目菏澤學院開放實驗室(植物生物學實驗室)項目；菏澤學院科研研究項目(XYJJKY-2，XY13KJ02)。

作者簡介方純嬌(1994- )，女，福建漳州人，本科生，專業(yè)：生物科學。*通訊作者，副教授，碩士，從事植物逆境生理研究。

收稿日期2016-03-29

中圖分類號S 601

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-041-02

Comparative Study on the Observation Method ofPaeoniasuffruticosaLeaf Stomata

FANG Chun-jiao, HAN Xue, SHI Dong-yan*et al

(Department of Life Sciences, Heze University, Heze, Shandong 274015)

Abstract[Objective] Five different methods of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis slice-preparing and the observation of stomata were comparatively studied. [Method] The slice of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermises were prepared with the method of directly tearing leaf epidermis, tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells, NaOH maceration, H2O2-HAC maceration and boiling-tearing leaf epidermis and the preparation index was compared and the best stain was screened. [Results] The treatment of tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells and H2O2-HAC maceration was best in all of preparation methods, which was less residual mesophyll and highly facticity. In the dyeing treatment, the treatment of 0.5% I-KI showed the good efficiency. [Conclusion] The foundation for the future research on the micro-morphological characteristics of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis of different varieties would be laid.

Key wordsPaeonia suffruticosa; Stoma; Observation method; Stomatal density