黃福海,潘麗英,徐楚燕

(1.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院,廣東 深圳　518106；2.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院，廣東 深圳　518104)

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半乳糖凝集素-9在卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

黃福海1,潘麗英2,徐楚燕1

(1.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院,廣東 深圳518106；2.深圳市寶安區(qū)沙井人民醫(yī)院，廣東 深圳518104)

摘要：目的觀察半乳糖凝集素-9(Galectin-9)在卵巢癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集該院外科手術(shù)切除的卵巢癌組織、癌旁組織(距離癌灶<2cm)及卵巢良性組織(距離癌灶≥2cm)各60例，采用免疫組化法及RT-PCR法檢測(cè)卵巢組織中Galectin-9蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果免疫組化證實(shí)卵巢癌組織中Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織及良性卵巢組織，癌旁組織中Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率低于卵巢良性組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR證實(shí)卵巢癌組織中Galectin-9mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織及良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9mRNA表達(dá)低于卵巢良性組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組化亦證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織中的Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。卵巢癌組織中Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率與病理類型，病理分級(jí)，TNM分期無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論Galectin-9低表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志及基因治療的靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：卵巢腫瘤;淋巴轉(zhuǎn)移;半乳糖凝集素-9

卵巢癌是女性生殖器官惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤首位，具有發(fā)現(xiàn)晚，進(jìn)展快及預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重的威脅女性健康及生命安全。并且由于卵巢居于盆腔底部，缺乏早期明顯特異，當(dāng)發(fā)現(xiàn)時(shí)常處于晚期[1-2]。因此，探尋卵巢癌早期診斷，早期治療的特異性腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是學(xué)者們?cè)?997年從鼠胚腎組織中分離得到的，是一種半乳糖苷結(jié)合蛋白，且含有一個(gè)包含130個(gè)氨基酸序列的糖識(shí)別區(qū)域。后續(xù)研究證實(shí)Galectin-9在自身免疫性疾病、炎癥、生殖及腫瘤等多種疾病中起重要作用[3-5]。已報(bào)道Galectin-9在食管鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、口腔鱗癌、膠質(zhì)瘤及肝癌中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生，進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[6]。從而說(shuō)明Galectin-9的異常表達(dá)可能也與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，并且Galectin-9有可能成為一種卵巢癌診斷標(biāo)志物。因此，本研究通過(guò)免疫組化及RT-PCR來(lái)檢測(cè)Galectin-9在卵巢癌、癌旁組織及良性卵巢組織中的表達(dá)，并探討Galectin-9與卵巢癌病理特征的關(guān)系，從而為卵巢癌的治療與預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源本研究選擇深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院及合作醫(yī)院外科2014年6月至2015年12月手術(shù)切除的卵巢癌組織、癌旁組織(距離癌灶<2cm)及卵巢良性組織(距離癌灶≥2cm)各60例納入研究。卵巢癌患者術(shù)前均未接受其他治療。所有病例都經(jīng)過(guò)病理組織學(xué)檢查確診為卵巢癌。有完整詳細(xì)的臨床和病理診斷資料，按照病理分級(jí)分為漿液型38例，黏液型12例，子宮內(nèi)膜樣型10例，按TNM標(biāo)準(zhǔn)分期分為，I+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期25例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的24例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。高分化12例，中分化25例，低分化23例。

1.2主要試劑及儀器鼠抗人Galectin-9多克隆抗體，羊抗鼠FITC-IgG，SP免疫組化檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物生物工程有限公司；ThermoShandonFinesse自動(dòng)切片機(jī)，購(gòu)自英國(guó)珊頓公司；Olympusbx40光學(xué)顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司。AEU-210型電子分析天平，購(gòu)自日本島津公司。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1RT-PCR參考trizol試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并檢測(cè)RNA純度。進(jìn)而通過(guò)RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。于凝膠成像系統(tǒng)拍照，Qantityone4.0 分析光密度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。引物如下，Galectin-9上游引物：5’-CATCCAATGCCATCCTCCTGTC-3’，TGAGCTTCACACAAGATCCACAC-3’，長(zhǎng)度235bp；GADPH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’，長(zhǎng)度138bp。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色法(SP)卵巢組織于10%甲醛溶液中固定24h，石蠟包埋、切片，用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Galectin-9的表達(dá)。操作過(guò)程為：采用高壓熱修復(fù)法修復(fù)抗原1.5min，室溫冷卻30min后PBS沖洗3次；再加入50μL3%過(guò)氧化氫溶液，室溫孵育10min后，PBS沖洗3次；采用非免疫性動(dòng)物血清室溫下封閉10min，甩去多余血清，PBS沖洗3次；滴加1%濃度的一抗，陰性對(duì)照組用PBS液代替一抗，室溫下孵育60min，PBS沖洗3次；滴加二抗，室溫孵育10min后，PBS沖洗3次，應(yīng)用DAB溶液顯色后沖洗、復(fù)染、脫水、透明、樹(shù)膠封片。

1.3.3結(jié)果判斷由兩位病理醫(yī)師根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)切片進(jìn)行半定量(HSCORE)評(píng)分，根據(jù)棕色的強(qiáng)弱評(píng)分為 0、1、2、3。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下的陽(yáng)性細(xì)胞百分比，總細(xì)胞數(shù)>1 000個(gè)。其中HSCORE=∑Pi(i)i=0、1、2、3,Pi= 0～100%，HSCORE>100 時(shí)，說(shuō)明切片為陽(yáng)性，HSCORE≤100 說(shuō)明切片陰性。

2結(jié)果

2.1正常卵巢組織、良性卵巢組織與卵巢癌組織中Galectin-9的表達(dá)卵巢癌組織中Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織和良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率低于良性卵巢組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，卵巢癌組織中Galectin-9mRNA的表達(dá)顯著低于癌旁組織和良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9mRNA的表達(dá)低于良性卵巢組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期的關(guān)系卵巢癌組織中Galectin-9陽(yáng)性與病理類型，病理分級(jí)，TNM分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表2～4。

2.3卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系免疫組化證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織中的Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率低于沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表5。

3討論

Galectin-9是半乳糖結(jié)合蛋白家族成員之一，能夠與細(xì)胞表面及間質(zhì)中的半乳糖特異性結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞間以及細(xì)胞與間質(zhì)間的信號(hào)傳遞作用。Galectin-9在人體多數(shù)組織中皆表達(dá)，包括腦、乳腺、胃、肝臟、肺臟、子宮、扁桃體等。同時(shí)Galectin-9參與了機(jī)體許多生理和病理過(guò)程，包括細(xì)胞間黏附、細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等。已報(bào)道Galectin-9在食管鱗狀細(xì)胞癌，乳腺癌、結(jié)直腸癌，胃癌，口腔鱗癌，膠質(zhì)瘤及肝癌中低表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[6]。郭素平等[7]證實(shí)食管鱗狀細(xì)胞癌中Galectin-9的陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常鱗狀組織，并與腫瘤的分化程度有關(guān)，且其陽(yáng)性表達(dá)者生存期更長(zhǎng)。Yang等[8]證實(shí)Galectin-9在胃正常組織，癌旁組織，胃癌組織中表達(dá)量逐漸降低，且胃癌組織中Galectin-9的低表達(dá)與臨床分期，腫瘤病理分子，腫瘤此分化，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存率密切相關(guān)。Liang等[9]通過(guò)免疫組化亦證實(shí)Galectin-9在子宮頸的正常鱗狀上皮、低度上皮內(nèi)瘤變、高度上皮內(nèi)瘤變和浸潤(rùn)期鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)水平逐漸降低。上述研究表明Galectin-9在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，Galectin-9可能也是卵巢癌新的診斷標(biāo)志物。因此本研究通過(guò)免疫組化及RT-PCR檢測(cè)卵巢癌組織中Galectin-9蛋白及mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中Galectin-9的陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA都顯著低于癌旁組織和良性卵巢組織，癌旁組織中的Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA表達(dá)低于良性卵巢組織，從而證實(shí)Galectin-9的表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此本研究進(jìn)一步探討Galectin-9與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明，卵巢癌組織中Galectin-9的陽(yáng)性表達(dá)與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期無(wú)關(guān)，與郭素平等[7]在食管鱗狀細(xì)胞癌中，Yang等[8]在胃癌組織中Galectin-9的陽(yáng)性表達(dá)與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期密切相關(guān)的觀點(diǎn)不一致，原因可能是腫瘤病例標(biāo)本的大小，組織的特異性所導(dǎo)致的。

表1　正常卵巢組織、良性卵巢組織與卵巢癌組織中Galectin-9的表達(dá)

注：與卵巢良性組織組比較，aP<0.01，與癌旁組織組比較，bP<0.01。

表2　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)

注：三類型中Galectin-9陽(yáng)性率比較，P>0.05。

表3　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)

注：三類型中Galectin-9陽(yáng)性率比較，P>0.05。

表4　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)

注：二類型中Galectin-9陽(yáng)性率比較，P>0.05。

表5　卵巢癌組織中Galectin-9蛋白表達(dá)

注：二類型中Galectin-9陽(yáng)性率比較，P<0.05。

轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致外科手術(shù)、化療、放療等失敗的主要原因，更是患者病情惡化的重要原因[10-11]。因此探討Galectin-9的表達(dá)與卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要意義。免疫組化結(jié)果證實(shí)免疫組化亦證實(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織中的Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)低于未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌組織，提示Galectin-9的表達(dá)與卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。并且以往研究也證實(shí)Galectin-9的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。如Kageshita等[12]證實(shí)Galectin-9在黑色素痣組織中高表達(dá)，在黑素瘤組織中低表達(dá)，尤其是在轉(zhuǎn)移性的黑素瘤中低表達(dá)更明顯。Chan等[13]證實(shí)Galectin-9在口腔鱗癌中低表達(dá)，并在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽(yáng)性表達(dá)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Zhang等[14]證實(shí)肝細(xì)胞癌中Galectin-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管侵襲及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且陽(yáng)性表達(dá)Galectin-9的肝細(xì)胞癌患者有更長(zhǎng)的生存時(shí)間。從而說(shuō)明Galectin-9與卵巢癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，以此為靶點(diǎn)，提高Galectin-9在卵巢癌組織中的表達(dá)，可能能顯著的抑制卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Galectin-9低表達(dá)可能與卵巢癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與組織病理類型，腫瘤分化程度，臨床分期無(wú)關(guān)，可能成為卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志及基因治療的靶點(diǎn)。

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.040

(收稿日期：2015-10-21，修回日期：2016-04-29)