朱妍妍，柏智能，唐麗琴

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥　230031;2.安徽省立醫(yī)院,安徽 合肥　230001)

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反相高效液相色譜法測(cè)定硫唑嘌呤代謝產(chǎn)物6-巰基嘌呤血漿藥物濃度

朱妍妍1,2，柏智能1,2，唐麗琴2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué),安徽 合肥230031;2.安徽省立醫(yī)院,安徽 合肥230001)

摘要：目的建立反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測(cè)人血漿中硫唑嘌呤(AZA)代謝產(chǎn)物6-巰基嘌呤(6-MP)的濃度，為臨床進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)提供基礎(chǔ)。方法采用Hypersil ODS2色譜柱(250 nm×4.6 nm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.3%冰乙酸化(3∶97)，流速為0.8 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm,血漿樣品經(jīng)15%高氯酸去蛋白后加氫氧鈉(NaOH)調(diào)節(jié)pH后20 μL進(jìn)樣分析。結(jié)果6-MP血漿樣品在0.02～2.00 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)下限(LLOQ)為0.02 mg·L-1；LLOQ、高濃度(1.5 mg·L-1)、中濃度(1 mg·L-1)和低濃度(0.05 mg·L-1)提取回收率分別為85.71%、92.93%、103.53%和96.02%，質(zhì)控四個(gè)濃度的日內(nèi)與日間精密度均<15.0%，符合中國(guó)藥典生物樣本分析相關(guān)規(guī)定。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)成功建立一種簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度的6-MP血漿濃度測(cè)定方法，符合AZA血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥代動(dòng)力學(xué)研究的相關(guān)規(guī)定。

關(guān)鍵詞：硫唑嘌呤；色譜法,反相；血藥濃度

硫唑嘌呤(azathioprine,AZA)是臨床上最常用的免疫抑制劑之一[1]，主要用來(lái)治療系統(tǒng)紅斑狼瘡、白血病、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病(IBD)等多種自身免疫性疾病及預(yù)防器官組織移植后排異反應(yīng)[2]。AZA本身是一種無(wú)活性的前體藥物，在體內(nèi)幾乎全部代謝為6-巰基嘌呤(6-MP)[3]。AZA口服生物利用度低，個(gè)體差異性大，具有劑量依賴(lài)性[4]，低劑量給藥治療效果差，高劑量給藥患者出現(xiàn)各種嚴(yán)重不良反應(yīng)[5]，據(jù)有關(guān)報(bào)道顯示，口服AZA后大約20%～30% 患者出現(xiàn)不良反應(yīng)，常見(jiàn)的有造血系統(tǒng)損害、 肝臟損害、感染、胰腺炎、胃腸道反應(yīng)、腫瘤等[6]。因此，為了提高臨床療效和減少不良反應(yīng)的發(fā)生，臨床服用AZA的患者需監(jiān)測(cè)6-MP的濃度。本研究成功建立了反相高效液相色潽法(RP-HPLC)測(cè)定人血漿中硫唑嘌呤代謝物6-MP濃度，該方法取血樣量少，對(duì)患者損傷小，操作簡(jiǎn)單、快速，有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適合臨床上用于進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測(cè)及相關(guān)藥動(dòng)學(xué)研究。

1儀器與試藥

1.1儀器和設(shè)備Waters高效液相色譜(包括2487紫外檢測(cè)器，515四元泵，TC-100柱溫箱，HS色譜工作站V400+)；JK-DY500型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)；BT25S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；XW-80A微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2藥品與試劑6-MP對(duì)照品(色譜純,Solarbio，20150225)，乙腈(色譜純，天津市福晨化學(xué)儀器廠，批號(hào)2014/10/22)；冰乙酸(分析純，無(wú)錫展望化工試劑有限公司，2014/08/20)；氫氧化鈉(分析純，安徽醫(yī)藥站化玻部)等。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱為Hypersil ODS2(250 nm×4.6 nm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.3%冰乙酸(3∶97)，流速為0.8 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，柱溫為30 ℃。

2.26-MP標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制取6-MP對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)定，至10 mL棕色容量瓶,移取800 μL0.05 μmol·L-1NaOH溶液溶解后，純化水定容至10 mL,即得1.00 g·L-1的6-MP貯備液。

2.3加藥血漿樣品預(yù)處理全血3 500 r·min-1離心10 min，取血漿樣品200 μL加入45 μL 15%高氯酸沉淀劑去除蛋白質(zhì)，渦旋振蕩1 min，15 000轉(zhuǎn)離心10 min，精密移取180 μL上清液，加入12 μL 4 mol· L-1NaOH溶液調(diào)pH， 20 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1專(zhuān)屬性在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，按“2.3”項(xiàng)下操作，檢測(cè)空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和加藥血漿樣品，6-MP與血漿中內(nèi)源性組分分離度高且峰形較好，分離度>1.5，空白血漿無(wú)雜質(zhì)峰干擾。6-MP的相對(duì)保留時(shí)間為7.040 min，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及線性范圍取180 μL空白血漿加入20 μL對(duì)照品溶液，配制成一系列濃度0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·L-1的質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作，20 μL進(jìn)樣檢測(cè)。以6-MP血漿濃度為自變量，峰高為因變量，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸分析，求得6-MP的直線回歸方程即標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y= 4 319.3X-13.486(n=7,r=0.999 9),結(jié)果表明6-MP在0.02～2.00 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,LLOQ為0.02 mg·L-1。

2.4.3方法準(zhǔn)確度和精密度按“2.4.2”項(xiàng)下操作，配制LLOQ、低、中、高4個(gè)濃度的質(zhì)控(QC)樣品各制備5份，按照“2.3”項(xiàng)下處理樣品，1 d測(cè)定1批，連續(xù)測(cè)定5 d,并同時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品濃度，對(duì)QC樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算本方法的準(zhǔn)確度(方法回收率)和精密度,結(jié)果見(jiàn)表1。

注：1為6-MP。

圖1　6-MP血漿色譜圖

2.4.4提取回收率按“2.4.2”項(xiàng)下操作，配制LLOQ、低、中、高4個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各制備5份，按“2.3”項(xiàng)下同法操作，20 μL進(jìn)樣分析,將實(shí)際所測(cè)峰高帶入當(dāng)日用流動(dòng)相配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得相應(yīng)濃度，計(jì)算其RSD，將計(jì)算所得濃度與理論濃度相比，即得提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　6-MP的提取回收率(n=5)

2.4.5穩(wěn)定性考察(1)反復(fù)凍融穩(wěn)定性:按照“2.4.2”項(xiàng)下操作，配制LLOQ、低、中和高4個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各制備5份，反復(fù)凍融3次后，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，20 μL進(jìn)樣檢測(cè)，RSD分別為9.05%、4.28%、3.08%和2.84%，均小于15%，符合中國(guó)藥典生物樣本分析相關(guān)規(guī)定。(2)樣品預(yù)處理后室溫放置穩(wěn)定性:按照“2.4.2”項(xiàng)下操作，配制LLOQ、低、中和高4個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各制備5份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，于不同時(shí)間進(jìn)樣檢測(cè)分析，室溫放置24 h內(nèi)，RSD分別為10.57%、1.85%、8.28%和8.73%，均小于15%，表明樣品預(yù)處理后室溫放置穩(wěn)定性符合中國(guó)藥典生物樣本分析相關(guān)規(guī)定。

3討論

3.1色譜條件的確定查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7]，多采用甲醇-水(5∶90)為流動(dòng)相。但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乙腈-冰醋酸為流動(dòng)相的色譜圖比甲醇-水(5∶90)更好，且流動(dòng)相乙腈和冰乙酸的配比對(duì)6-MP出峰時(shí)間及峰形均有較大影響，乙腈的比例能顯著影響6-MP的出峰時(shí)間，冰乙酸的比例顯著影響峰形。經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定以乙腈-0.3%冰乙酸(3∶97)為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。在此色譜條件條件下，6-MP與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)分離完全，且峰形更好，保留時(shí)間合適，檢測(cè)效率較高，更適于臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

3.2血樣處理方法血漿樣品的處理方法會(huì)嚴(yán)重影響的測(cè)定結(jié)果，液-液萃取法步驟較復(fù)雜，而直接沉淀法則簡(jiǎn)單易行，臨床上使用較多，但該方法仍存在一定的弊端，如有的蛋白沉淀劑并不能使蛋白沉淀完全，常易導(dǎo)致色譜柱堵塞，提取回收率過(guò)低等。本研究經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，采用15% 高氯酸作為沉淀劑,沉淀較為完全，分離效果較好,方法提取回收率高，且該法操作簡(jiǎn)單，只需沉淀離心即可，更適用于臨床進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)[8-9]。

4結(jié)論

本課題成功篩選出靈敏度高、選擇性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)、分析快速等優(yōu)點(diǎn)的人血漿中6-MP的HPLC測(cè)定方法，快速簡(jiǎn)捷、采血量少，其準(zhǔn)確度和精密度良好，符合生物樣本分析要求，符合臨床藥物濃度監(jiān)測(cè)和人體藥代動(dòng)力學(xué)研究需要。

參考文獻(xiàn)

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Determination of 6-mercaptopurine in human plasma by RP-HPLC

ZHU Yan-yan1,2,BAI Zhi-neng1,2,TANG Li-qin2

(1.AnhuiUniversityofChineseMedcine,Hefei,Anhui230031,China;2.DepartmentofPharmacy,AnhuiProvincialHospital,Hefei,Anhui230001,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a reversed phase high-performance liquid chromatography(RP-HPLC)method to determine 6-mercaptopurine (6-MP) in human plasma,thereby providing the foundation for clinical blood concentration monitoring.MethodsUsing Hypersil ODS2 column (250 nm ×4.6 nm,5 μm),the mobile phase was acetonitrile -0.3% glacial acetic acid (3∶97),the flow rate was 0.8 mL · min-1,the detection wavelength was set at 323 nm,and plasma samples were extracted by 20 μL 15% perchloric acid.ResultsA linearity was observed within the rangefrom 0.02 mg ·L-1to 2.00 mg ·L-1,the lowest detection limit was 0.02 mg ·L-1,the average method recovery rate of four concentrations were 85.71%,92.93%,103.53% and 96.02%,respectively,and the intra-day and inter-day precision are<15% and in line with the Chinese Pharmacopoeia biological sample analysis regulations.ConclusionsThe experiment successfully established a simple,fast,and low cost 6-MP plasma concentration measuring method with high sensitivity and good stability.Particularly,the method needs less blood.It is also in line with the relevant provisions of the AZA blood drug concentration monitoring and pharmacokinetics study.

Key words:Azathioprine;Chromatography,reverse-phase;Plasma concentration

通信作者：唐麗琴,女，教授,主任藥師,碩士生導(dǎo)師，研究方向：臨床藥學(xué)和藥理學(xué)，E-mail:tulcyl@vip.sina.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.015

(收稿日期：2016-04-06,修回日期：2016-05-06)