馬承慧　王群　　　　劉牧

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)　　　　(北京林業(yè)大學(xué))

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7種松科植物松針提取物的體外抗氧化活性比較1)

馬承慧王群劉牧

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)(北京林業(yè)大學(xué))

摘要以油松、雪松、紅松、日本冷杉、青海云杉、樟子松和藍粉云杉7種松科植物的松針為實驗原料，以二苯基苦味肼基自由基(DPPH自由基)清除率、羥自由基清除率和總還原能力為指標，比較7種松科植物松針提取物酚類物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)及其抗氧化能力的差異，并分析抗氧化活性與其多酚、黃酮和原花青素質(zhì)量分數(shù)之間的相關(guān)性。實驗結(jié)果表明，7種松科植物松針提取物的多酚質(zhì)量分數(shù)介于29.72～54.21 mg/g ，其中油松的多酚質(zhì)量分數(shù)最高；黃酮質(zhì)量分數(shù)介于6.72～11.06 mg/g，其中雪松的黃酮質(zhì)量分數(shù)最高；原花青素質(zhì)量分數(shù)介于2.26～7.29 mg/g，其中雪松的原花青素質(zhì)量分數(shù)最高。DPPH自由基清除能力的IC50值最低的為油松，羥自由基清除能力的IC50值與總還原能力EC50值最低的均為雪松。相關(guān)性分析表明，多酚質(zhì)量分數(shù)與DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原能力均存在顯著相關(guān)性，在抗氧化能力中起到了主要作用。因此，松針多酚因其具有較好的抗氧化能力可作為一種天然的抗氧化劑。

關(guān)鍵詞松科植物；松針；多酚；抗氧化

植物多酚類化合物是一類擁有一個或多個芳香環(huán)并含有一個或幾個羥基基團的混合物，一般分為黃酮類化合物、木脂素類化合物、兒茶素和原花青素類化合物等，其廣泛存在于植物體內(nèi)[1-2]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對植物多酚的生理功能開展了深入的研究[3]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化能力，能夠?qū)⒀趸M程抑制或者中斷，并且平衡機體自由基的數(shù)量[4]，可預(yù)防氧化應(yīng)激所引發(fā)的如動脈粥樣硬化、心腦血管疾病、老年癡呆癥、帕金森氏病、腫瘤等疾病[5-6]。松科植物體內(nèi)含有大量多酚類的化合物，其具有獨特的化學(xué)性質(zhì)和生物活性，因此將其稱為松多酚[7]，在松科植物中多酚類化合物也往往和糖類、多酚類化合物通過糖苷鍵結(jié)合，其功能也往往表現(xiàn)出這些復(fù)合物的特性[8]。研究表明松多酚具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、防治心腦血管疾病，以及抑菌等多種生理功能[9-13]。

由于松科植物種類多樣，針對紅松、法國海岸松、落葉松等松科植物體內(nèi)多酚研究的報道較多，而關(guān)于其它松科及種類間的多酚質(zhì)量分數(shù)差異及抗氧化性能力的研究尚未見報道。本研究選用紅松、油松、雪松、樟子松、藍粉云杉、日本冷杉和青海云杉7種松科植物，測定并比較其多酚、黃酮和原花青素質(zhì)量分數(shù)；選用DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和總還原能力為指標，探討其抗氧化能力之間的差異，同時分析多酚類物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)與其抗氧化能力的相關(guān)性，為松科植物資源的開發(fā)利用與多酚的深入研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

油松、雪松、藍粉云杉、日本冷杉和青海云杉取自北京；紅松、樟子松取自哈爾濱，采集時間2014年5月份，采集成熟針葉。松針樣品低溫干燥后粉碎過40目篩備用。

1.2方法

1.2.1松針多酚的提取

準確稱量5 g經(jīng)過烘干并且脫脂后的松針粉，以體積分數(shù)60%的乙醇為溶劑，m(樣品)∶V(溶劑)=1 g∶30 mL(料液比)，60 ℃水浴4 h，抽濾、離心后得松多酚提取液，將松多酚提取液濃縮干燥后，得到多酚樣品。

1.2.2DPPH自由基清除能力的測定

分別取配置成一系列質(zhì)量濃度的多酚溶液1 mL，加入3 mL 10-4mol/L二苯基苦味肼基自由基(DPPH)混勻，室溫放置30 min后，在波長517 nm處測定吸光值A(chǔ)i，用無水乙醇代替DPPH測定吸光值A(chǔ)j，以無水乙醇代替多酚溶液測定吸光值A(chǔ)0，平行實驗3次取平均值，按下式計算松多酚對DPPH自由基的清除能力。

清除率=(1-(AiAj/A0))×100%。

1.2.3羥自由基清除能力的測定

分別取配置成一系列質(zhì)量濃度的多酚溶液1 mL，加入1 mL的1 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 1 mmol/L過氧化氫溶液，2 mL的3 mmol/L水楊酸溶液混勻，室溫放置30 min后，在波長510 nm處測得吸光值A(chǔ)i，用蒸餾水代替水楊酸測定吸光值A(chǔ)j，用蒸餾水代替多酚溶液測定吸光值A(chǔ)0，平行實驗3次取平均值，清除率計算公式同1.2.2。

1.2.4總還原能力的測定

分別取配置成一系列質(zhì)量濃度的多酚溶液1 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH為6.6的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液。50 ℃水浴20 min，流水冷卻后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，以3 000 r/min速度離心10 min。取2.5 mL的上清液加入2.5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，室溫放置10 min，在700 nm波長下測定吸光值；以蒸餾水代替松多酚提取物調(diào)零，平行實驗3次取平均值。

1.2.5酚類物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的測定

多酚質(zhì)量分數(shù)的測定：采用國標方法，以沒食子酸制作標準曲線，具體方法參見文獻[14]。

黃酮質(zhì)量分數(shù)的測定：采用國標方法，以蘆丁制作標準曲線，具體方法參照文獻[15]。

原花青素質(zhì)量分數(shù)的測定：采用正丁醇鹽酸法測定，具體方法參照文獻[16]。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析、差異顯著性比較、IC50值和EC50值的計算及相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1DPPH自由基清除能力比較

DPPH自由基的清除率可以用來評價單一或混合多酚類化合物的抗氧化活性，測定DPPH自由基清除率的方法具有簡單快速等優(yōu)點[17]。二苯基苦味肼基自由基(DPPH自由基)遇到松針多酚時，與其多酚中的酚羥基結(jié)合或發(fā)生替代，使得游離的DPPH自由基的數(shù)量減少，在其特征吸收光下吸收減小，表現(xiàn)為由紫色變?yōu)榈S色[18]。7種松科植物松針多酚對DPPH自由基的清除率如圖1?？芍?，7種松針多酚對DPPH自由基的清除率存在量效關(guān)系，其質(zhì)量濃度的增加可顯著增強DPPH自由基的清除作用；當質(zhì)量濃度達到一定值后，DPPH自由基清除率達到最高限度，不再隨樣品質(zhì)量濃度的升高而增加。油松、藍粉云杉的松針多酚在0～150 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除作用顯著增強；當質(zhì)量濃度達到150 mg/L之后，隨樣品質(zhì)量濃度升高，DPPH自由基清除作用增加不顯著。雪松的松針多酚在0～180 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基的清除作用顯著增強；當質(zhì)量濃度達到180 mg/L之后，DPPH自由基清除作用增加不顯著。紅松、樟子松、青海云杉和日本冷杉的松針多酚當質(zhì)量濃度達到200 mg/L之后，DPPH自由基清除作用達到最大值。7種松針多酚最終所達到的最大清除率從大到小依次為：雪松、油松、日本冷杉、藍粉云杉、紅松、青海云杉、樟子松。

圖1　DPPH自由基清除能力

2.2羥自由基清除能力的比較

羥自由基具有較強的得電子能力，會誘導(dǎo)DNA鏈斷裂和堿基改性從而引起如癌癥等一系列疾病。羥自由基在Fenton體系中產(chǎn)生(Fe2++H2O2→Fe3++HO·+OH-)[19]。在實驗中加入松多酚這種具有抗氧化活性的物質(zhì)，可以直接清除羥自由基或阻斷Fenton反應(yīng)，從而減少羥自由基的產(chǎn)生量。7種松科植物松針多酚對羥自由基的清除率見圖2?？芍?，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，7種松多酚對羥自由基的清除率逐漸上升，當質(zhì)量濃度達到一定值以后，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加變化緩慢且趨為平緩，即清除能力達到了最高限度。油松、藍粉云杉、雪松、日本冷杉、青海云杉、樟子松和紅松質(zhì)量濃度分別達到0.60、1.00、0.35、3.50、2.50、0.80、0.80 g/L時，羥自由基清除作用達到最大值。7種松針多酚最終所達到的最大清除率從大到小依次為：油松、紅松、雪松、樟子松、藍粉云杉、日本冷杉、青海云杉。

圖2　羥自由基清除能力

2.3總還原能力的比較

采用普魯士藍法測定總還原力，氰離子在抗氧化劑自身還原作用下與硫酸亞鐵作用生成亞鐵氰絡(luò)鹽，酸化后與高鐵離子生成普魯士藍。普魯士藍在700 nm波長下有最大吸收峰，因此多酚化合物的抗氧化性越強，其吸光度越大。7種松科植物松針多酚的總還原能力見圖3?？芍?種松科植物松針多酚的總還原能力與質(zhì)量濃度之間均呈現(xiàn)出顯著的線性相關(guān)，油松、藍粉云杉、雪松、日本冷杉、青海云杉、樟子松和紅松的相關(guān)系數(shù)分別為：0.964 4、0.997 6、0.979 6、0.993 3、0.991 7、0.997 5和0.983 8?？傔€原能力從大到小依次是雪松、藍粉云杉、油松、日本冷杉、樟子松、紅松和青海云杉。

圖3　總還原能力

2.4抗氧化活性的IC50和EC50值比較

IC50值表達的是自由基清除率達到50%時所需要的抗氧化劑質(zhì)量濃度，EC50值表達的是總還原能力中吸光值為0.5時所需要的抗氧化劑質(zhì)量濃度，IC50值和EC50值與抗氧化能力呈逆相關(guān)。7種松針多酚的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力的IC50值和總還原能力的EC50值見表1。可知，油松松針多酚清除DPPH自由基的IC50值最小，因此在較小質(zhì)量濃度下油松松針多酚清除DPPH自由基的能力要大于同等質(zhì)量濃度的其他松科植物，顯示出極強的清除DPPH自由基的能力。樟子松對羥自由基清除能力的IC50值最小，在較小質(zhì)量濃度下樟子松松針多酚清除羥自由基的能力要大于同等質(zhì)量濃度下的其他松科植物。雪松松針多酚總還原能力的EC50值低于其他幾種松科植物。

表1DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力的IC50值

和總還原能力的EC50值

mg·L-1

注：表中數(shù)值為平均值±標準差。

2.5主要抗氧化物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)與抗氧化活性相關(guān)性分析

2.5.1主要抗氧化物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)

7種松針多酚的抗氧化成分質(zhì)量分數(shù)見表2。

表27種松針中多酚、黃酮、原花青素質(zhì)量分數(shù)

mg·g-1

注：表中數(shù)值為平均值±標準差；同列不同小寫字母代表差異顯著，p<0.05。

2.5.2相關(guān)性分析

7種松針多酚的抗氧化活性(表3)與其主要抗氧化物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)(表2)的相關(guān)性見表4。

表3　7種松多酚抗氧化活性

注：DPPH自由基清除率為最大可達到值；羥自由基清除率為最大可達到值；總還原能力測定中樣品質(zhì)量濃度為800 mg/L。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，多酚質(zhì)量分數(shù)與DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原能力都具有顯著相關(guān)性，多酚分子中含有的大量酚羥基結(jié)構(gòu)是其抗氧化性能的關(guān)鍵，酚羥基作為氫的供體，捕捉氧化過程中產(chǎn)生的自由基，從而終止自由基引發(fā)的氧化進程。這說明了多酚類物質(zhì)中能提供電子的物質(zhì)與多酚質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)。黃酮質(zhì)量分數(shù)只與總還原能力有顯著的相關(guān)性，原花青素質(zhì)量分數(shù)與DPPH自由基清除能力和總還原能力有顯著相關(guān)性，這可能與其質(zhì)量分數(shù)較少、富集位置不同有關(guān)。因此松科植物松針中多酚物質(zhì)與其抗氧化能力間的關(guān)系密切，說明多酚是松科植物松針中抗氧化的重要物質(zhì)之一。

表4　主要抗氧化物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)與抗氧化活性相關(guān)性分析

注：*在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；** 在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

3結(jié)論與討論

分析7種松科植物松針中多酚類物質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)及其抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)不同松科植物中多酚、黃酮和原花青素的質(zhì)量分數(shù)存在顯著差異，其中多酚質(zhì)量分數(shù)最高的為油松，黃酮和原花青素質(zhì)量分數(shù)最高的均為雪松。體外抗氧化活性實驗結(jié)果表明7種松多酚均可以有效地清除生理和非生理自由基(羥自由基和DPPH自由基)，在清除DPPH自由基方面，雪松具有最大清除率，油松IC50值最?。磺宄u自由基方面，油松具有最大的清除率，樟子松IC50值最??；雪松的總還原能力最大。因此綜合看來，雪松與油松的抗氧化性高于其他5松科植物。分析主要抗氧化物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)與抗氧化能力間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)多酚質(zhì)量分數(shù)與DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原能力都具有顯著相關(guān)性，表明多酚是松科植物松針中抗氧化的重要物質(zhì)之一。

研究表明自由基可以引起膜脂LPO，蛋白質(zhì)(蛋白羰基構(gòu)造PC)和核酸分子的氧化性損傷，機體中多種抗氧化劑如GSH、GST、CAT、SOD、GPx和DR協(xié)同作用保持自由基的質(zhì)量濃度相對較低[11]，但由于飲食的不健康、環(huán)境污染嚴重、生活壓力大都會導(dǎo)致自由基的增加，而自由基或氧化劑會將細胞和組織分解，影響正常的代謝功能，并會引起不同的健康問題[20]。因此近年來對天然植物中抗氧化活性成分的研究越來越多。多酚化合物廣泛分布于植物體中，具有較好的抗氧化性能。目前國內(nèi)植物多酚的來源多為茶葉、水果、谷物及一些常見的堅果等。本實驗從7種松科植物針葉提取的粗多酚質(zhì)量分數(shù)最高，為(54.21±1.58)mg/g，堅果中多酚質(zhì)量分數(shù)較高的為核桃((12.52±0.03)mg/g)[21]，漿果中多酚質(zhì)量分數(shù)最高的為花楸(6.25 mg/g)[22]，雜糧中多酚質(zhì)量分數(shù)較高的為苦蕎((2.845 6±0.100 0)mg/g)，主糧中質(zhì)量分數(shù)較高的為小麥((0.191 1±0.010 0)mg/g)[23]，常見的一些水果和蔬菜多酚質(zhì)量分數(shù)：蘋果(2.09 mg/g)[24]、香蕉(0.406 5 mg/g)、西紅柿(0.643 8 mg/g)、西葫蘆(0.105 4 mg/g)、土豆(0.314 9 mg/g)[25]等。7種松科植物的松針中均富含多酚，且具有較強的抗氧化活性。同時松科植物在我國分布廣泛，具有顯著的資源優(yōu)勢。因此松針作為植物多酚重要來源，已成為一種無毒副作用的天然抗氧化劑，在食品、化妝品、保健品和醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

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Antioxidant Activity of Seven Pinaceae Plant Extracts from Pine Needlesinvitro

Ma Chenghui, Wang Qun

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Liu Mu(Beijing Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(6)：45-48.

With seven pine needles fromPinussylvestris,Cedrusdeodara(Roxb.) G. Don,Pinuskoraiensis,Abiesfirma,Piceacrassifolia,PinustabuliformisandPiceapungens, and taking scavenging rate of DPPH free radicals, hydroxyl free radicals and the total reducing power of them as indexes, we related the antioxidant capacity of different Pinaceae extracts from the seven pine needles to the phenolics content and analyzed the correlation between the antioxidant activity and the content of phenols, proanthocyanidins and flavonoids. The polyphenol content of Pinaceae extractes from the seven pine needles was in 29.72-54.21 mg/g, andPinustabulaeformiscontains the highest polyphenols content. The flavonoids content was in 6.72-11.06 mg/g, andC.deodarawas with the highest flavonoids content. The proanthocyanidins content was in 2.26-7.29 mg/g, andC.deodarawas with the highest content of proanthocyanidins.Pinustabulaeformishas the lowest IC50value of scavenging rate of DPPH free radicals.C.deodarawas with the lowest IC50value of scavenging rate of hydroxyl free radicals and the lowest EC50value of the total reducing power. The scavenging rate of DPPH, hydroxyl free radicals and reducing power were positively correlated to the content of polyphenol which played a major role in antioxidant properties. Pine needle polyphenols had good antioxidant capacity, and can be used as a kind of natural antioxidant.

KeywordsPinaceae plants； Pine needles； Polyphenols； Antioxidant activity

第一作者簡介：馬承慧，女，1959年7月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，高級工程師。E-mail：515026498@qq.com。

收稿日期：2015年10月30日。

分類號S718.43

1)國家自然科學(xué)基金項目(C160131170510)。

責任編輯：戴芳天。