徐興夢，葉 靈，張鳳梅，劉春波，申欽鵬，何 沛，司曉喜，朱瑞芝，王昆繆，劉志華，繆明明*

(1.云南省煙草化學重點實驗室/云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231;2.昆明醫(yī)科大學 藥學院/云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500)

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基質(zhì)固相分散-高效液相色法測定電子煙煙油中的苯并[α]芘

徐興夢1,2，葉 靈1，張鳳梅1，劉春波1，申欽鵬1，何 沛1，司曉喜1，朱瑞芝1，王昆繆1，劉志華1，繆明明1*

(1.云南省煙草化學重點實驗室/云南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231;2.昆明醫(yī)科大學 藥學院/云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500)

摘要：采用基質(zhì)固相分散-高效液相色法測定電子煙煙油中的苯并[α]芘(B[α]P)，電子煙煙油樣品用硅膠分散，然后用帶柱層析凈化功能的索氏提取器凈化，經(jīng)提取凈化后的樣品用超高效液相色譜-熒光檢測測定，該方法中B[α]P的檢出限為3.5 ng/mL，定量限為10.0 ng/mL，樣品B[α]P加標回收率在91.2%～95.7%之間。采用該方法的樣品前處理可避免常規(guī)樣品前處理過程中的多次轉(zhuǎn)移、濃縮，簡化了操作步驟，縮短了前處理時間，有效減少分析誤差，且有機溶劑用量大大減少，減少了對環(huán)境的污染。該方法用于電子煙煙油樣品的測定，結(jié)果令人滿意。

關鍵詞：基質(zhì)固相分散；高效液相色譜法；電子煙煙油；苯并[α]芘

苯并[α]芘(B[α]P)是第1個被發(fā)現(xiàn)的多環(huán)芳烴類環(huán)境致癌物，也是眾多的多環(huán)芳烴中致癌活性最強的化合物；腫瘤流行病學調(diào)查及動物實驗研究發(fā)現(xiàn)B[α]P具有較強致癌性，尤其與人類肺癌的發(fā)生高度相關[1]。目前B[α]P的測定已列為煙草安全評價的重要檢測指標。電子煙作為一種新型煙草制品，是通過直接霧化電子煙油來產(chǎn)生煙氣；由于避免了復雜的煙絲燃燒，其有害成分釋放量比常規(guī)卷煙大大減少[2]。但是電子煙煙油成分復雜，含甘油、丙二醇、煙草提取物、食用香料等多種人工合成或天然植物提取成分，在煙油制備過程中原料和使用的溶劑都有可能會受到污染而含B[α]P。因此電子煙油中苯并[α]芘的測定對保障電子煙的安全性具有一定意義，目前電子煙油中苯并[α]芘的測定還未見文獻報道過。

目前B[α]P測定已得到實際應用的方法是GC-MS法[2-6]和HPLC-FLD法[7-11]。由于樣品基體成分復雜，B[α]P的含量又屬于痕量分析，樣品基質(zhì)中又存在大量的干擾物質(zhì)，因此B[α]P的測定都需要通過復雜的樣品處理，前處理方法主要有溶劑提取、固相萃取或凝膠色譜(GPC)凈化等方法。這些方法樣品前處理需多次的濃縮、轉(zhuǎn)移，操作非常麻煩，可引入實驗誤差的因素多；而且耗費大量有機溶劑，對環(huán)境污染大。我們研究了用基質(zhì)固相分散-高效液相色法測定電子煙油中的B[α]P。電子煙油用硅膠分散，然后用帶柱層析凈化功能的索氏提取器凈化。經(jīng)提取凈化后的樣品用超高效液相色譜-熒光檢測測定。與常規(guī)B[α]P測定的方法相比，該方法簡化了樣品前處理操作步驟，提高了分析結(jié)果的精密度；此外，新裝置還能顯著減少前處理過程中有機溶劑用量，大大降低了樣品前處理過程中有機溶劑向環(huán)境中的散發(fā)，從而減少了樣品處理過程中的環(huán)境污染。方法實際應用于電子煙煙油中B[α]P的測定，取得了滿意的結(jié)果。

1實驗部分

1.1材料、試劑與儀器

電子煙煙油均購于淘寶網(wǎng)。

B[α]P標準品(純度>98%,Αldrich,USA)；環(huán)己烷、乙醇和乙腈(色譜純，DIKMA Pure，USA)；無水硫酸鈉(分析純，由天津化學試劑廠生產(chǎn))；200～300目硅膠(分析純，由青島海洋化工廠生產(chǎn))。

分析天平(感量0.0001 g，瑞士Mettler Toledo公司)；ACQUITY超高效液相色譜儀(配熒光檢測器)，美國Waters公司，Empower色譜工作站；KQ-500 DB超聲波清洗器(廣州滬瑞明儀器有限公司)。

1.2帶柱層析功能的索氏提取裝置

帶柱層析功能的索氏提取裝置結(jié)構(gòu)見圖1，該裝置由回流冷凝管(1)、提取器(3)和圓底燒瓶(8)3部分組成，燒瓶的底部設有一段1～2 mL的尾管(7)，提取器是由溶劑氣流管(4)和填料管(15)上部相連而成的“U”形管，溶劑氣流管下端接燒瓶磨口(5)，填料管中裝有篩板(11)。填料管上端接回流冷凝管(1)，下端的管件通過三通閥(10)后接于燒瓶，三通閥的另一出口接溶劑回收口(9)，回流冷凝管的液滴出口垂直正對填料管上方。

提取器為異徑的“U”形管，溶劑氣流管的管徑為10～15 mm，填料管的管徑為35～40 mm，提取器與回流冷凝管相接的磨口(2)至填料管底部的距離為160～200 mm。

篩板上放置柱層析材料硅膠層(12)，樣品(13)置于硅膠層上面，再在上面加一層無水硫酸鈉(14)用于樣品干燥。燒瓶中加入溶劑(6)，加熱回流時蒸發(fā)上來的溶劑通過三通閥回到圓底燒瓶形成回流；樣品提取完后轉(zhuǎn)動三通閥至溶劑回收口，溶劑則可從回收出口流出，實現(xiàn)樣品濃縮。

圖1　新樣品前處理裝置的結(jié)構(gòu)圖

1.3測定方法

1.3.1標準溶液的配制B[α]P標準溶液的配制：精密稱取10.0 mg苯并[α]芘，用環(huán)己烷溶解后移入100 mL棕色容量瓶中，并稀釋至刻度，得到含苯并[α]芘0.01 mg/mL的儲備液；使用時用環(huán)己烷稀釋成所需濃度的標準工作液。

1.3.2色譜條件色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×50 mm)，柱溫40 ℃；流動相為乙腈/水(68/32)，流速0.5 mL/min；熒光檢測器(FID)的激發(fā)波長384 nm；發(fā)射波長406 nm；在該色譜條件下苯并[α]芘標樣和電子煙油的液相色譜圖見圖2。

圖2　標樣(b)和煙油樣品(α)的色譜圖

1.3.3樣品處理準確稱取電子煙油樣品5.0 g，然后在樣品中加入10.0 g的硅膠和煙油樣品充分研磨均勻。在圖1所示的索氏提取裝置中加入10 g硅膠層，然后把上述附著了煙油樣品的硅膠加到索氏提取器中，再在上面鋪2.5 g無水硫酸鈉。裝好樣品后，在燒瓶中加入80 mL己烷-乙醇(98∶2)的混合溶劑，然后將上述樣品前處理裝置放入水浴鍋中，在90 ℃下加熱回流45 min提取樣品。樣品提取完后，打開三通閥(10)，讓溶劑從溶劑回收口流出回收溶劑，直至燒瓶尾管中的樣品溶液蒸發(fā)到近干。用1 mL的乙腈溶解尾管中的殘留物，溶液經(jīng)針頭過濾器過濾，按選定色譜條件測定苯并[α]芘含量。

2結(jié)果與分析

2.1方法原理

對苯并[α]芘的測定，樣品前處理分為樣品提取、固相萃取(或柱層析)凈化、濃縮三步[12]；一般采用的方法為樣品用環(huán)己烷提取，然后用硅膠固相萃取柱(或反相固相萃取)凈化，然后再供儀器分析用。而采用本文中的索氏提取裝置，啟動水浴鍋加熱，溶劑蒸發(fā)后再經(jīng)回流冷凝管(1)冷凝回到提取器中；經(jīng)無水硫酸鈉層(14)干燥，然后再把樣品中的苯并[α]芘洗脫下來；經(jīng)過下面的硅膠柱(12)凈化，這樣雜質(zhì)保留在硅膠柱上，而苯并[α]芘則被溶劑洗脫而進入圓底燒瓶中，經(jīng)過一段時間的回流提取，樣品中的苯并[α]芘被完全提??；然后轉(zhuǎn)換三通閥，讓溶劑從溶劑回收出口流出，這樣圓底燒瓶中的溶液不斷被濃縮，當濃溶劑快蒸發(fā)完后，用乙腈溶解尾管中的殘留物，即可供液相色譜分析用。

2.2萃取、凈化溶劑的選擇

苯并[α]芘測定樣品前處理的關鍵步驟是硅膠固相萃取凈化，溶劑的選擇非常重要，溶劑對硅膠柱的洗脫強度適當才能將苯并[α]芘從硅膠柱上洗脫，并讓雜質(zhì)更多地保留在柱上，從而達到樣品凈化的目的。傳統(tǒng)方法一般用一種洗脫強度小的溶劑(環(huán)己烷)和一種洗脫強度大的溶劑(乙醇或異丙醇)混合作為洗脫劑，通過調(diào)配兩者的比例調(diào)節(jié)洗脫強度。在本方法中，要求2種溶劑的沸點相近，以保持在水浴加熱時能達到基本同時氣化。環(huán)己烷的沸點(80.6 ℃)和乙醇的沸點(78.4 ℃)非常接近，而且傳統(tǒng)的柱層析分離中也經(jīng)常使用這2種溶劑混合調(diào)節(jié)溶劑強度作為正相色譜的流動相，因此本實驗中選擇環(huán)己烷和乙醇混合作為本實驗中的提取、凈化溶劑。結(jié)果表明：環(huán)己烷和乙醇的比例為98∶2時具有最好的樣品提取、凈化效果，不但能讓待測成分完全被洗脫，而且還能讓電子煙油中的其他雜質(zhì)吸附在硅膠上達到樣品凈化的效果。因此，本實驗中選擇環(huán)己烷-乙醇(98∶2)作為前處理中的溶劑。

2.3萃取劑體積的選擇

在本實驗中，需在提取裝置中加入足夠量的溶劑，以保持溶劑在整個前處理過程中能循環(huán)；本實驗中采用體積為50 mL的提取管，實驗表明，當提取裝置中的溶劑量達60 mL時能保持正常循環(huán)，但考慮到在樣品前處理過程中溶劑因蒸發(fā)而有少量損失，因此選擇在提取器中加入80 mL的環(huán)己烷-乙醇混合溶劑。

2.4水浴溫度的選擇

在本實驗中，環(huán)己烷的沸點為80.6 ℃，乙醇的沸點為78.4 ℃，當水浴溫度超過85 ℃時，尾管燒瓶中的溶劑開始沸騰，隨著溫度增加，溶劑蒸發(fā)速度迅速加快，當溫度達到90 ℃時溶劑蒸發(fā)速度能達到5 mL/min左右(稍大于硅膠柱上的流下速度)，溫度過低則蒸發(fā)慢，需延長樣品處理時間，溫度過高則會增加提取過程中的溶劑損失，因此，實驗選擇水浴溫度為90 ℃。

2.5萃取時間的選擇

選取經(jīng)硅膠分散、烘干后的電子煙油樣品，在90 ℃的水浴中進行回流提取，考察提取時間對苯并[α]芘測定結(jié)果的影響。比較了提取時間分別為20、25、30、35、40、45、50、60 min的測定結(jié)果，結(jié)果表明：萃取時間在40 min以后萃取效率達到一個穩(wěn)定值，苯并[α]芘的測定結(jié)果趨于穩(wěn)定，進一步延長提取時間則會導致更多的雜質(zhì)被洗脫而影響樣品的凈化效果；為節(jié)約時間并避免引入更多的干擾成分，因此，選擇回流45 min作為樣品提取的最佳時間。

2.6色譜條件的選擇

在選定色譜柱的情況下，筆者對流動相進行了選擇,由于本方法采用熒光檢測器檢測，用甲醇作為流動相背景值高，因此采用乙腈-水作為流動相。并且實驗設置了不同比例的乙腈和水作為流動相(包括梯度)，結(jié)果表明：用梯度洗脫基線不平，會向上漂移；用等度洗脫基線相對平穩(wěn)，用68%的乙腈-水溶液為流動相，待測成分能達到基線分離且時間短，因此本實驗選用68%的乙腈-水作為流動相。

通過熒光檢測器掃描可得苯并[α]芘的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖，苯并[α]芘最大激發(fā)波長為384 nm，最大發(fā)射波長為406 nm，因此本實驗中選擇該激發(fā)波長和發(fā)射波長。

2.7工作曲線、檢出限和檢測限

準確稱取一定量的苯并[α]芘標準樣品，配制一系列標準溶液(10.0、20.0、40.0、80.0、120.0、200.0 ng/mL)進行HPLC分析，以標樣峰面積(A)和濃度(C)進行線性回歸，得到線性回歸方程。苯并[α]芘的回歸方程為：A=2682C+14.56，線性范圍為10～200 ng/mL，r=0.9996；根據(jù)信噪比(S/N=3)得苯并[α]芘的檢出限為3.5 ng/mL，根據(jù)信噪比(S/N=10)得到苯并[α]芘的定量限為10.0 ng/mL。

2.8精密度實驗

電子煙油樣品按本實驗前處理方法處理后，在相同條件下平行測定7次(同批次處理)，并計算7次平行測定結(jié)果的相對標準偏差，可得苯并[α]芘的RSD為3.5%，說明本方法精密度良好。同上，樣品處理完后在不同時間內(nèi)測定(每天測定1次，共7次)，計算7次測定結(jié)果的相對標準偏差，可得苯并[α]芘的RSD為4.0%，說明在不同時間內(nèi)測定，本方法精密度仍然良好。

2.9回收率與檢測限實驗

電子煙油樣品測定時每樣準備相同樣品4份，其中1份為參比，另3份分別加入已知量的標品(苯并[α]芘)，設10、30、50 ng共3個添加量。樣品按選定的樣品前處理條件進行處理，并按選定色譜條件進樣分析，通過加入標準的測出量除以標準加入量計算回收率；得到苯并[α]芘的回收率，在91.9%～93.6%之間，說明本方法回收率較好。

2.10樣品分析結(jié)果

采用本方法對電子煙煙油中的苯并[α]芘進行測定，并用文獻[12]報道的環(huán)己烷萃取凈化法進行對照。由表1可知，采用本方法的測定結(jié)果與文獻報道方法的分析結(jié)果具有較好的一致性，說明本方法準確可靠。

表1　電子煙煙油中苯并[α]芘的測定結(jié)果

注：/表示低于定量限。

3結(jié)論

本文研究了用基質(zhì)固相分散-高效液相色法測定電子煙煙油中的苯并[α]芘。本方法采用硅膠基質(zhì)固相分散處理，然后用帶柱層析凈化功能的索氏提取器凈化。采用該裝置可將常規(guī)方法中的提取、柱層析凈化、濃縮三步在線連接起來，避免了樣品前處理過程中的轉(zhuǎn)移、濃縮，簡化了操作步驟，還可有效地減少分析誤差，使測定結(jié)果更加準確，而且樣品處理在相對封閉的裝置中完成，避免了常規(guī)前處理方法中許多敞開操作，減少了有機溶劑向環(huán)境中的散發(fā)，降低了環(huán)境污染。本方法還采用超高效液相色譜技術，12 min完成一個樣品分析，與常規(guī)液相色譜法相比，分離時間大大縮短，提高了工作效率。實際樣品分析結(jié)果表明，本方法的回收率高，重復性好，且測定結(jié)果與對照方法檢驗結(jié)果相符合。

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(責任編輯：曾小軍)

Study on Determination of Benzo [α] Pyrene in Electronic Cigarette Liquids by Using Matrix Solid-phase Dispersion and High Performance Liquid Chromatography

XU Xing-meng1,2, YE Ling1, ZHANG Feng-mei1, LIU Chun-bo1, SHEN Qin-peng1, HE Pei1,SI Xiao-xi1, ZHU Rui-zhi1, WANG Kun-miao1, LIU Zhi-hua1, MIAO Ming-ming1*

(1. Key Laboratory of Tobacco Chemistry of Yunnan Province/ Research and Development Center, China Tobacco Yunnan Industrial Limited Company, Kunming 650231, China; 2. College of Pharmaceutical Science, Kunming Medical University/ Yunnan Provincial Key Laboratory of Pharmacology for Natural Drugs, Kunming 650500, China)

Abstract：A matrix solid-phase dispersion and RP-HPLC method for the determination of benzo [α] pyrene (B[α]P) in electronic cigarette liquids was studied, the electronic cigarette liquids samples were dispersed with silica gel, then the samples were purified by silica gel column chromatography combined with cable extraction, the purified samples were analyzed by high performance liquid chromatography equipped with fluorescence detector, the detection limit and quantitative limit for B[α]P reaches 3.5 ng/mL and 10.2 ng/mL, respectively, the developed method provide spiked recoveries of 91.2%～95.7% for B[α]P. In addition, compared to the tradition sample preparation method, the operation steps was greatly simplified, the environmental pollution was also reduced with lessen organic solvents used in this method, this method was applied to the determination of B[α]P in electronic cigarette liquids with good results.

Key words：Matrix solid-phase dispersion; High performance liquid chromatography; Electronic cigarette liquids; Benzo [α] pyrene

收稿日期：2015-11-18

基金項目：國家自然科學基金(21365026)。

作者簡介：徐興夢(1992─)，女，云南麗江人，碩士研究生，從事藥物分析研究。*通訊作者：繆明明。

中圖分類號：O657.63

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)06-0092-04