何聰聰， 鄧　威， 梅運(yùn)軍

( 武漢輕工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430023 )

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武陵山區(qū)四株真菌的分離與初步鑒定

何聰聰， 鄧威， 梅運(yùn)軍

( 武漢輕工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430023 )

摘要：從武陵山區(qū)分離到4株真菌，并對(duì)4株真菌的ITS序列進(jìn)行了擴(kuò)增與測(cè)序，MEGA6軟件構(gòu)建了真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)得知菌株HBM1、HBM2和菌株HBM3遺傳關(guān)系較近，三者隸屬Schizophyllumcommune，菌株HBM4隸屬I(mǎi)rpexlacteus。

關(guān)鍵詞：真菌；ITS；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；裂褶菌；白囊耙齒菌

1引言

真菌是自然界廣泛分布的一類(lèi)真核生物，是一種寶貴的自然資源，具有重要的食用及藥用價(jià)值。目前已記載的食藥用真菌大約有2 500種，國(guó)內(nèi)報(bào)道的食藥用真菌約1 000種。已探明的具有明顯藥效的真菌為400余種，而真正作為藥物使用的僅20-30種[1-2]。因此，分離、篩選和鑒定真菌對(duì)豐富真菌種質(zhì)資源具有十分重要的意義。

在真菌的分類(lèi)鑒定中，傳統(tǒng)的真菌鑒定主要依據(jù)形態(tài)學(xué)、抗原構(gòu)造、生理生化等特點(diǎn)，由于出發(fā)點(diǎn)和依據(jù)不同，常出現(xiàn)分類(lèi)難以統(tǒng)一；而隨著真菌DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)，如將核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)引入到真菌的分類(lèi)鑒定中，由于該分類(lèi)鑒定不受個(gè)體形態(tài)特征、發(fā)育階段的影響，能客觀準(zhǔn)確區(qū)分物種，且操作便捷，因此在真菌的分類(lèi)鑒定中得到了廣泛應(yīng)用[3-6]。

本研究旨在從自然土樣中分離食藥用真菌，并通過(guò)真菌ITS序列對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)鑒定，為豐富食藥真菌的種質(zhì)資源，進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用真菌資源奠定一定的基礎(chǔ)。

2材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1菌株來(lái)源

菌株分離自武陵山區(qū)湖南省張家界與湖北省恩施州交界處土樣，分離所得4株真菌編號(hào)為HBM1、HBM2、HBM3、HBM4。

2.1.2培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：200 g 馬鈴薯、20 g 葡萄糖、12 g 瓊脂、1000 mL 蒸餾水、121 ℃滅菌25 min 、pH自然。PDA液體培養(yǎng)基不加瓊脂，其它成分與處理方式與PDA固體培養(yǎng)基一致。

2.1.3儀器

Eppendorf Mastercycler PCR儀(艾本德, 德國(guó))。

2.1.4試劑

引物及PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；其它試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1真菌分離與純化

取土壤樣品10 g 投入盛有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，并向三角瓶中投入10粒粒徑大約5 mm滅菌玻璃珠，經(jīng)充分震蕩后梯度稀釋至10-4。取上述各梯度的稀釋液50 μL涂布于含PDA培養(yǎng)基的平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落再次于PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)直至無(wú)雜菌。

2.2.2DNA提取

從平板上用接種鏟接種1 cm×1 cm純化真菌種子至盛有PDA的液體培養(yǎng)基三角瓶中180 r/min，28 ℃培養(yǎng)6 d。真菌DNA提取參照文獻(xiàn)[7-8]。

2.2.3PCR擴(kuò)增真菌ITS序列

本實(shí)驗(yàn)選擇ITS1和ITS4為真菌ITS擴(kuò)增引物[9]。以上述抽提的DNA為模板，ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR總體系為25 μL，具體組成為10×PCR緩沖液 2.5 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 μL，引物(5 μmol/L)各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL (5 U/μL)，無(wú)菌水19 μL，模板0.5 μL。PCR反應(yīng)條件依次為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.2.4測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Blast軟件比對(duì)GenBank上核苷酸序列并選擇相似度高的序列。將測(cè)序得到的ITS序列與高度相似序列用CLUSTALX軟件生成fasta序列格式，然后運(yùn)用MEGA6軟件分別構(gòu)建Neighbor-Joining (NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、Maximum Likelihood (ML)發(fā)育樹(shù)以及Minimum-Evolution (ME)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。根據(jù)Felsenstein[10]所使用的方法將發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的評(píng)估參數(shù)bootstrap值設(shè)置為1000。

3結(jié)果與分析

3.1菌株的培養(yǎng)特征

從武陵山區(qū)湖南省張家界與湖北省恩施州交界處土壤樣品中分離到4株菌落形態(tài)各異的真菌菌株，分別編號(hào)為HBM1、HBM2、HBM3、HBM4，如圖1所示。其中菌株HBM1在PDA 培養(yǎng)基上于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)7 d 后，菌落表面為白色絨狀，菌絲密集，氣生菌絲明顯且菌絲較長(zhǎng)，基質(zhì)白色；菌株HBM2在28 ℃下，在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d之后，菌絲稀疏且在培養(yǎng)基中呈白色、輻射狀，基質(zhì)白色；HBM3菌絲生長(zhǎng)緩慢，菌落白色絨狀，基質(zhì)白色；HBM4菌落白色呈絨氈狀，菌絲密集較短，基質(zhì)白色。

圖1　4株真菌的菌落形態(tài)

3.2ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

經(jīng)測(cè)序后，得到菌株 HBM1、HBM2、HBM3和HBM4的ITS序列長(zhǎng)度分別為597、597、597和635 bp，在GenBank上的登錄號(hào)分別為KU726503、KU726504、KU726505、KU726506。分別將所測(cè)得的序列進(jìn)行Blast比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

3.2.1菌株HBM1、HBM2及HBM3 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立及分析

菌株HBM1、HBM2及HBM3之間ITS序列經(jīng)多重比對(duì)其相似性為99%，僅有1—2 個(gè)位點(diǎn)核苷酸不同，分別位于ITS1區(qū)和ITS2區(qū)。此外，三者ITS序列分別于NCBI上經(jīng)Blast比對(duì)，結(jié)果顯示HBM1、HBM2及HBM3 ITS序列與Schizophyllum屬菌株的相似性最高，達(dá)到了99%。由于該屬的菌種種類(lèi)過(guò)少，為了加強(qiáng)發(fā)育樹(shù)的穩(wěn)定性，選取分?jǐn)?shù)最高的四個(gè)ITS序列相似性為100% 的菌株Schizophyllumcommune(KJ588263.1)、Schizophyllumcommune(FJ372688.1)、Schizophyllumcommune(KP202299.1)、Schizophyllumcommune(KP202296.1)，并結(jié)合該屬的其他菌株構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2(顯示節(jié)點(diǎn)值≥50，圖中括號(hào)內(nèi)的標(biāo)注為相應(yīng)菌株rRNA在GenBank中的登錄號(hào))。由圖2可知，菌株HBM1、HBM2及HBM3與裂褶菌Schizophyllumcommune的四個(gè)菌株形成了一個(gè)穩(wěn)定的分支(節(jié)點(diǎn)值為85)，表明這三株菌與Schizophyllumcommune親緣關(guān)系最近；但三者在發(fā)育樹(shù)中的進(jìn)化地位有所差別，序列ITS序列不完全相同，這可能是存在種間變異，可能為Schizophyllumcommune的不同亞種。ML與ME系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也顯示HBM1、HBM2及HBM3具有類(lèi)似的進(jìn)化關(guān)系，如圖3和圖4所示。根據(jù)Renske Landeweert等對(duì)真菌的分子分類(lèi)鑒定原則，即通過(guò)ITS區(qū)域比對(duì)，序列相似性≥99%，可判定為相同種；序列相似性在95%—99%之間，可判定為相同屬；序列相似性≤95%，可判定為相同科[6-7]。因此根據(jù)ITS同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，菌株HBM1、HBM2和HBM3都隸屬于S.commune。

圖2　HBM1、HBM2和HBM3及其參考菌株的rDNA ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3　HBM1、HBM2和HBM3及其參考菌株的rDNA ITS序列的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4　HBM1、HBM2和HBM3及其參考菌株的rDNA ITS序列的ME系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.2.2菌株HBM4 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立及分析

菌株HBM4 ITS序列測(cè)序結(jié)果在NCBI Blast比對(duì)后，結(jié)果顯示HBM4的ITS序列與白囊耙齒菌屬I(mǎi)rpex的序列相似性最高(99%)；在序列相似性≥99%的ITS序列中Irpex屬菌株所占的比例約為99%。由于該屬的菌種種類(lèi)過(guò)少，為了加強(qiáng)發(fā)育樹(shù)的穩(wěn)定性，選取分?jǐn)?shù)最高的四個(gè)ITS序列相似性為100%的白囊耙齒菌IrpexlacteusJX311924.1、 HM992801.1、JX290573.1及JX290578.1，并結(jié)合該屬的其他菌種構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖5(顯示節(jié)點(diǎn)值≥50)。由圖5可知，菌株HBM4與白囊耙齒菌Irpexlacteus的四個(gè)菌株形成了一個(gè)穩(wěn)定的分支(節(jié)點(diǎn)值為99)表明HBM4與白囊耙齒菌Irpexlacteus親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化上應(yīng)屬于同一亞類(lèi)群。構(gòu)建的ML、ME系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果基本一致，如圖6和圖7。根據(jù)Renske Landeweert等對(duì)真菌的分子分類(lèi)鑒定原則，結(jié)合ITS與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，HBM4隸屬于白囊耙齒菌Irpexlacteus。

圖5　HBM4及其參考菌株的rDNA ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6　HBM4及其參考菌株的rDNA ITS序列的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖7　HBM4及其參考菌株的rDNA ITS序列的ME系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

4結(jié)束語(yǔ)

本研究從土壤樣品中分離與純培養(yǎng)到4株有益真菌，利用真菌ITS序列通過(guò)MEGA6軟件分別構(gòu)建了NJ、ML、ME系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。初步鑒定HBM1、HBM2及HBM3三株菌隸屬于裂褶菌(S.commune)，而HBM4則隸屬于白囊耙齒菌(I.lacteus)。該研究對(duì)豐富和發(fā)掘我國(guó)真菌資源具有一定的意義，但后續(xù)的研究和開(kāi)發(fā)還需要進(jìn)一步的深入。

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Isolation and primary identification of four fungi from Wuling mountainous area

HECong-cong,DENGWei,MEIYun-jun

(School of Chemical and Environmental Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023, China)

Abstract：Four fungi isolates were isolated from soil and their ITS sequences were amplified, sequenced and phylogenetically analyzed to identify species of the isolates. The result showed that the genetic distances of isolate HBM1, HBM2 and HBM3 were closer, all of three were belonged toSchizophyllum; the isolate HBM4 was classified asIrpexlacteus.

Key words：fungus; ITS; phylogenetic tree;Schizophyllum;Irpexlacteus

收稿日期：2016-03-01.修回日期：2016-04-20.

作者簡(jiǎn)介：何聰聰 (1990-)，女，碩士研究生，E-mail: hecongcongwh@163.com. 通訊作者：梅運(yùn)軍 (1975-)，男，博士，副教授,E-mail: meiyunjun_2000@163.com.

基金項(xiàng)目：湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(D20151704).

文章編號(hào)：2095-7386(2016)02-0030-06

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.02.005

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 93-331

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A