鄔旭龍，肖璐?，姜睿姣，王印,2*，楊澤曉,2，姚學(xué)萍,2，張鵬飛，張博(.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 630；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 630)

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靶序列富集多重PCR技術(shù)的發(fā)展及其應(yīng)用

鄔旭龍1，肖璐1?，姜睿姣1，王印1,2*，楊澤曉1,2，姚學(xué)萍1,2，張鵬飛1，張博1
(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

摘 要：靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR, Tem–PCR)作為一種新型的分子生物學(xué)高通量檢測技術(shù)，通過靶序列富集、靶序列加標(biāo)簽以及超級(jí)引物擴(kuò)增3個(gè)階段實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)序列的大量擴(kuò)增。靶序列富集多重PCR具有獨(dú)特的反應(yīng)過程，克服了常規(guī)多重PCR擴(kuò)增條件不兼容、擴(kuò)增具有偏愛性等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一反應(yīng)體系多種病原的同步檢測，為臨床病原鑒別診斷、基因分型、耐藥基因等領(lǐng)域的研究提供了新思路，具有較大的發(fā)展前景。筆者對(duì)Tem–PCR的研究背景、反應(yīng)原理、技術(shù)應(yīng)用及試劑盒開發(fā)等進(jìn)行綜述，旨在為Tem–PCR的研究和發(fā)展提供參考依據(jù)，為中國應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生危機(jī)提供新思路。

關(guān) 鍵 詞：靶序列富集多重PCR；高通量；生物技術(shù)；公共衛(wèi)生

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目前，實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要以分子生物學(xué)方法為主，其中應(yīng)用最為廣泛的當(dāng)屬PCR技術(shù)[1]。普通PCR反應(yīng)一次只能針對(duì)單一病原進(jìn)行檢測。多重PCR的靶序列擴(kuò)增條件不同，難以找出通用反應(yīng)條件。在疫情暴發(fā)的緊急時(shí)刻，用常規(guī)PCR方法排查多病原會(huì)受到極大的限制。近年來出現(xiàn)的烈性傳染病“非典”(SARS)、H5N1、H7N9、埃博拉(Ebola)、中東呼吸綜合征(MERS)等，使全球公共衛(wèi)生安全遭受到了巨大的威脅和挑戰(zhàn)，因此，迫切需要一種高效、精準(zhǔn)的診斷技術(shù)為突發(fā)疫病的快速診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測提供有力的技術(shù)支持。Tem–PCR是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)勢在于既克服了單一PCR檢測的低效問題，又解決了多重PCR不同引物擴(kuò)增條件不兼容等難題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同一反應(yīng)體系多種病原的同步檢測，為不同病原微生物的鑒別診斷及重大疫情疫病的實(shí)時(shí)監(jiān)測提供了保障，同時(shí)為分子鑒別診斷技術(shù)(molecular differential diagnoses, MDD)的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)[2–3]。筆者對(duì)靶序列富集多重PCR技術(shù)的發(fā)展及其應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為中國研發(fā)Tem–PCR技術(shù)提供參考。

1　Tem–PCR的原理

1.1引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)目標(biāo)靶序列設(shè)計(jì)1對(duì)巢式特異性引物和1對(duì)能識(shí)別標(biāo)簽序列的超級(jí)引物。巢式特異性引物包括外引物Fo(Forward out)、Ro(Reverse out)和內(nèi)引物Fi(Forward in)、Ri(Reverse in)。內(nèi)引物Fi、Ri 的5′端添加一段非同源性序列作為標(biāo)簽。Fi與Ri的標(biāo)簽序列不同，標(biāo)簽序列以10～20 bp為宜。再設(shè)計(jì)1對(duì)能識(shí)別標(biāo)簽序列的超級(jí)引物Fs(Forward Super Primer )和Rs(Reverse Super Primer)，并僅在Rs的5′端加上熒光素標(biāo)記[4]。

1.2反應(yīng)原理

Tem–PCR反應(yīng)分3個(gè)階段進(jìn)行[4]：第1階段是巢式外引物特異性識(shí)別待檢靶標(biāo)序列，此階段低濃度的巢式引物量和較少的循環(huán)次數(shù)主要用于最初靶標(biāo)序列的富集；第2階段是添加標(biāo)簽，巢式內(nèi)引物5′端帶有與待檢靶標(biāo)序列無同源性的通用序列，提高退火溫度至68～72 ℃，此時(shí)不同的靶標(biāo)序列被標(biāo)記上相同的標(biāo)簽序列[5]；第3階段是超級(jí)引物特異性識(shí)別標(biāo)簽序列，并在擴(kuò)增過程中以生物素標(biāo)記Tem–PCR產(chǎn)物。Tem–PCR產(chǎn)物以液相芯片技術(shù)(flexible multiple-analyte profiling, solve for unknown x, xMAP)為檢測平臺(tái)，通過xMAP將核酸芯片技術(shù)和流式熒光檢測技術(shù)有效地結(jié)合在一起，將熒光編碼微球、激光檢測、流式細(xì)胞術(shù)和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則等多項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行整合[6]。通過微球不同濃度配比形成不同的標(biāo)記信號(hào)。微球與靶標(biāo)序列特異性探針共價(jià)偶聯(lián)，特異性核酸探針在液相環(huán)境中捕獲Tem–PCR產(chǎn)物，最終以流式細(xì)胞術(shù)作為光學(xué)檢測手段，通過計(jì)算機(jī)高速數(shù)字信號(hào)進(jìn)行處理，完成對(duì)靶標(biāo)序列的高通量檢測(圖1)。

圖1　 Tem–PCR擴(kuò)增示意圖Fig. 1 Amplification schema of the Tem–PCR

2　Tem–PCR的應(yīng)用

Tem–PCR自2003年開創(chuàng)以來，經(jīng)過數(shù)十年的研究和發(fā)展，在病原微生物鑒別診斷、病原基因分型、耐藥基因研究以及食品衛(wèi)生安全等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。基于Tem–PCR，國內(nèi)已有學(xué)者在早期建立了一些病原微生物的檢測方法[7–8]，但自2010年后，尤其是近幾年來，國內(nèi)對(duì)Tem–PCR技術(shù)的研究和應(yīng)用相對(duì)滯后，而國外已研制出多種病原微生物的Tem–PCR檢測試劑盒。

2.1在病原檢測中的應(yīng)用

呼吸道病原微生物的高通量鑒別診斷是目前Tem–PCR應(yīng)用最多的領(lǐng)域。Xiao等[9]利用Tem–RT–PCR對(duì)采集到的臨床樣品進(jìn)行了2組試驗(yàn)，分別是對(duì)5種流感病毒基因分型和14種主要呼吸道病原進(jìn)行檢測，對(duì)108份疑似感染流感病毒患者咽喉拭子進(jìn)行檢測的結(jié)果表明，該方法對(duì)H1N1、H3N2、B型流感病毒的檢測靈敏度達(dá)4～10 copies vRNA/μL，對(duì)H5亞型的檢測靈敏度為200 copies vRNA/μL；對(duì)88份從兒童醫(yī)院采集到的鼻炎吸取物進(jìn)行常見呼吸道病原檢測的結(jié)果顯示，除對(duì)呼吸道合胞病毒的檢測靈敏度為400 copies vRNA/μL外，對(duì)其余病毒(包括人類偏肺病毒、冠狀病毒、人博卡病毒等)的檢測靈敏度為10～150 copies vRNA/μL。通過將流感病毒分型試驗(yàn)與商業(yè)化多重PCR試劑盒進(jìn)行比較和將呼吸道病原檢測方法與常規(guī)單重PCR進(jìn)行比較，證實(shí)該方法具有很高的檢測靈敏度和特異性，檢測結(jié)果的一致性為93.2%～100.0%，表明該方法具有很強(qiáng)的實(shí)用性和潛在的發(fā)展力。

Hassoun等[10]從醫(yī)院采集到200份咽喉拭子，采用Tem–PCR方法對(duì)22種呼吸道感染常見的病毒性疾病和19種細(xì)菌感染疾病進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在100份冬季(1—2月)采集的樣品中至少有34份存在單一細(xì)菌感染，至少有11份存在單一病毒性感染，其中對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、莫拉菌和冠狀病毒的檢出率最高；100份夏季(6—7月)采集的樣品中，有37份樣品至少存在1種細(xì)菌感染，有4份樣品至少存在1種病毒性感染，其中對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的檢出率較高。該試驗(yàn)結(jié)果表明病原微生物的感染存在多重混合感染的情況，且不同季節(jié)存在不同的病原感染情況。

2.2在病毒基因分型中的應(yīng)用

宮頸癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性健康。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的直接病因[11]。Jian Han等[12]基于Tem–PCR檢測技術(shù)，對(duì)采集到的109份疑似HPV陽性女性宮頸拭子進(jìn)行檢測，并與第二代雜交捕獲法(hybridcapture Ⅱ，HC–2)的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示2種方法檢測結(jié)果的一致率為95.4%，表明該方法具有很高的檢測靈敏度。該方法包括對(duì)樣品DNA的提取，在5 h內(nèi)可完成樣品檢測，可作為HPV分型的快速、可靠的診斷工具。HPV與全球女性的生殖健康息息相關(guān)，借助Tem–PCR對(duì)其進(jìn)行輔助診斷，可降低其常規(guī)檢測的假陽性率，提高診斷的精確度。

人鼻病毒(HRVs)是公認(rèn)的一種需要長期治療的呼吸道疾病，因其治療周期長而導(dǎo)致對(duì)HRVs的分型調(diào)查受限制。Mubareka等[13]采集已表現(xiàn)出發(fā)燒、咳嗽、鼻炎等臨床癥狀患者的鼻咽拭子，通過Tem–PCR對(duì)樣品進(jìn)行檢測，并篩選出陽性感染HRVs樣品進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示，71份樣品中有56份呈陽性；對(duì)HRV進(jìn)行分型的研究結(jié)果表明，98%的毒株被鑒定為HRVs–A1，占據(jù)了主要的基因型。Tem–PCR應(yīng)用已在病原微生物分子流行病學(xué)調(diào)查和病原分型研究中取得了顯著的成績。

2.3在耐藥基因研究中的應(yīng)用

Huff等[14]采用Tem–PCR技術(shù)，同時(shí)對(duì)80 421份樣品進(jìn)行流感嗜血桿菌(haemophilus influenzae)、肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus)、莫拉菌(moraxella catarrhalis)、甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus)檢測，并且對(duì)病原菌抗四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示：抗四環(huán)素耐藥基因的總檢出率最高，為40.5%。對(duì)5種病原的檢出率分別為28.7%、36.3%、12.4%、25.1%、10.0%，而且存在2種或3種病原菌混合感染情況。結(jié)果證實(shí)Tem–PCR適合對(duì)多樣品和多靶基因進(jìn)行檢測，在高通量診斷中優(yōu)勢突出。對(duì)病原微生物耐藥性的研究關(guān)系到人類和動(dòng)物的切身利益，Tem–PCR對(duì)推進(jìn)病原微生物的耐藥性研究具有十分重要的意義。

2.4Tem–PCR商品化試劑盒的研發(fā)和應(yīng)用

目前基于Tem–PCR應(yīng)用最廣泛的是人類呼吸道疾病檢測試劑盒ResplexⅠ、ResplexⅡ、ResplexⅢ。ResplexⅠ主要針對(duì)細(xì)菌性的呼吸道病原，包括鏈球菌、葡萄球菌、克雷伯菌等23種病原；ResplexⅡ主要針對(duì)RNA病毒性的呼吸道病原，包括SARS、冠狀病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒(A、B)、副流感病毒(1、2、3、4)、鼻病毒、柯薩奇病毒和埃可病毒等；Resplex Ⅲ[15]主要針對(duì)甲型流感病毒的H5N1基因分型，將甲型流感病毒的H1、H2、H3、H5、H7、H9、N1、N2 基因，以及甲型流感病毒和乙型流感病毒的NS基因作為目標(biāo)，為流感病毒的鑒別診斷和基因分型提供了一種有效的快速檢測方法。

Loens等[16]分別采用Resplex Ⅱ、熒光定量RespiFinder plus和RespiFinder smart共3種商品化試劑盒，對(duì)采集到的48份支氣管拭子樣品進(jìn)行13種呼吸道病原檢測，結(jié)果顯示，ResplexⅡ的檢出率僅為43.8%，而其他2種試劑盒的檢出率分別為83.3%、75.0%。Hayden等[17]采用Resplex Ⅱ和FilmArray對(duì)采集到的176份患者樣品進(jìn)行檢測，并根據(jù)病人年齡、樣品數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，2種方法檢測的一致性為83.8%，用FilmArray至少檢出一種病原的陽性率為68.8%，用ResPlex Ⅱ至少檢出一種病原的陽性率為56.8%。Asner等[18]利用ResPlex Ⅱ試劑盒檢測438份鼻咽拭子和痰液臨床樣品中的甲型、乙型流感病毒和副流感病毒、冠狀病毒等17種呼吸道病原，并將檢測結(jié)果與TaqMan熒光定量檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，用熒光定量法檢測到274份樣品為陽性(62.6%)，而用ResPlex Ⅱ試劑盒只檢測到201份樣品為陽性(45.9%)，ResPlex Ⅱ的檢測靈敏度有待提高。近年來基于Tem–PCR開發(fā)的試劑盒逐漸增多，Deng[19]、Ritzi[20]、Mak[21]、Balada[22]、Gharabaghi[23]、Forman[24]、Pang[25]等利用Tem–PCR試劑盒對(duì)病原微生物進(jìn)行了檢測和基因分型。

2.5在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

在食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用中，劉忠梅等[26]利用Tem–PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)，對(duì)購買于市場的豬肉、雞肉、牛奶、香腸中的沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157 、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌共5種食源性致病菌進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果與國家檢測標(biāo)準(zhǔn)(GB—4789)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，Tem–PCR檢測方法的靈敏度都小于100 cfu/mL(金黃色葡萄球菌的為620 cfu/mL，除外)，該方法的檢測結(jié)果與用國家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測結(jié)果基本一致，具有很好的實(shí)用性。

3　展望

在病原微生物的實(shí)驗(yàn)室診斷中，分子生物學(xué)診斷已成為應(yīng)用最廣的方法之一。Tem–PCR技術(shù)的問世，既實(shí)現(xiàn)了單一反應(yīng)體系多病原同時(shí)檢測的目的，又克服了普通多重PCR反應(yīng)條件的不兼容，使反應(yīng)的特異性和敏感性降低。Tem–PCR既保證了不同靶序列擴(kuò)增的特異性，又縮小了彼此間擴(kuò)增效率的差異，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前，國內(nèi)對(duì)Tem–PCR的關(guān)注度較低，對(duì)其研究的投入力度較少。國外在多年前就已開始研發(fā)Tem–PCR相關(guān)試劑盒，目前對(duì)其新型試劑盒的開發(fā)已經(jīng)在臨床應(yīng)用中取得了顯著的成績。對(duì)Tem–PCR的研究和應(yīng)用以人類疾病的檢測為主，近年來在農(nóng)林畜牧方面的應(yīng)用已經(jīng)起步[26]，隨著Tem–PCR技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，其應(yīng)用領(lǐng)域有擴(kuò)展至動(dòng)物疫病監(jiān)測的趨勢，當(dāng)前已在積極建立常見的動(dòng)物疫病和一類疫病的Tem–PCR檢測方法[27]，致力于研發(fā)出相應(yīng)的商品化檢測產(chǎn)品。

Tem–PCR具有快速、高效和高通量的優(yōu)勢，在應(yīng)對(duì)公共衛(wèi)生危機(jī)方面避免了耗時(shí)、費(fèi)力的大量排查，可為處理突發(fā)事件提供科學(xué)依據(jù)。拓寬Tem–PCR技術(shù)在臨床疾病診斷中的應(yīng)用，推進(jìn)新的試劑盒研發(fā)和生產(chǎn)，使其在公共衛(wèi)生安全診斷中發(fā)揮更大的優(yōu)勢，將是Tem–PCR未來的發(fā)展方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] Tang Y W，Stratton C W．Advanced techniques in diagnostic microbiology[M]．Berlin：Springer，2013：166–183．

[2] Han W N，Zhang Z J，Ya X R，et al．The application of molecular differential diagnoses platform in identification of the respiratory pathogens[J]．Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2010，26(11)：1146–1148．

[3] Schneider H．Consider further differential diagnoses[J]. Deutsches Arzteblatt International，2014，111(14)：251．

[4] 李瑾，申紅衛(wèi)，秦萌，等．新型多重PCR方法及其在呼吸道病毒診斷上的應(yīng)用[J]．病毒學(xué)報(bào)，2013，29(6)：638–645．

[5] 韓衛(wèi)寧，韓?。肿予b別診斷領(lǐng)域的革命性技術(shù)Tem–PCR[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25(2)：184–186．

[6] Dunbar S A，Ritchie V B，Hoffmeyer M R，et al. Luminex? multiplex bead suspension arrays for the detection and serotyping of Salmonella spp.[J]．Methods in Molecular Biology，2015，1225：1–27．

[7] 韓衛(wèi)寧，張正姬，雅雪蓉，等．分子鑒別診斷(MDD)技術(shù)在呼吸道病原體檢測中的應(yīng)用[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2010，26(11)：1146–1148．

[8] 鄒淑梅，韓健，溫樂英，等．常見呼吸道病毒分子鑒別診斷技術(shù)的建立[J]．中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2006，20(2)：17–20．

[9] Xiao Y L，Jin Y C，Mei K，et al．Development of high-throughput liquid chips for respiratory virus detection[J]．Clinical Laboratory，2014，60(3)：347–361．

[10] Hassoun A，Huff M D，Weisman D，et al．Seasonal variation of respiratory pathogen colonization in asymptomatic health care professionals：A single-center，cross-sectional，2-season observational study[J]．American Journal of Infection Control，2015，43(8)：865–870．

[11] Peng S，Wang J W，Karanam B，et al．Sequential cisplatin therapy and vaccination with HPV16 E6E7L2 fusion protein in saponin adjuvant GPI–0100 for the treatment of a model HPV16+ cancer[J]．Plos One，2015，10(1)：e116389．

[12] Han J，Swan D C，Smith S J，et al．Simultaneous amplification and identification of 25 human papillomavirus types with templex technology[J]. Journal of Clinical Microbiology，2006，44(11)：4157–4162．

[13] Mubareka S，Louie L，Wong H，et al．Co-circulation of multiple genotypes of human rhinovirus during a large outbreak of respiratory illness in a veterans' long-term care home[J]．Journal of Clinical Virology，2013，58(2)：455–460．

[14] Huff M D，Weisman D，Adams J，et al．The frequency of tetracycline resistance genes co-detected with respiratory pathogens：A database mining study uncovering descriptive trends throughout the United States[J]．BMC Infectious Diseases，2014，14(1)：460–469．

[15] Zou S，Han J，Wen L，et al．Human influenza A virus (H5N1) detection by a novel multiplex PCR typing method[J]．Journal of Clinical Microbiology，2007，45(6)：1889–1892．

[16] Loens K，van Loon A M，Coenjaerts F，et al．Performance of different mono-and multiplex nucleic acid amplification tests on a multipathogen external quality assessment panel[J]．Journal of Clinical Microbiology，2012，50(3)：977–987．

[17] Hayden R T，Gu Z，Rodriguez A，et al．Comparison of two broadly multiplexed PCR systems for viral detection in clinical respiratory tract specimens from immunocompromised children[J]．Journal of Clinical Virology，2012，53(4)：308–313．

[18] Asner S，Waters V，Solomon M，et al．Role of respiratory viruses in pulmonary exacerbations in children with cystic fibrosis[J]．Journal of Cystic Fibrosis，2012，11(5)：433–439．

[19] Deng J，Ma Z，Huang W，et al．Respiratory virus multiplex RT–PCR assay sensitivities and influence factors in hospitalized children with lower respiratory tract infections[J]．Virologica Sinica，2013，28(2)：97–102．

[20] Ritzi-Lehnert M，Himmelreich R，Attig H，et al．On-chip analysis of respiratory viruses from nasopharyngeal samples[J]．Biomedical Microdevices，2011，13(5)：819–827．

[21] Mak G C，Cheng P K，Lim W．Evaluation of qiagen Resplex II for the detection of pandemic influenza A (H1N1) 2009 and influenza A (H3N2) virus[J]．Journal of Clinical Virology，2011，51(1)：88–89．

[22] Balada-Llasat J M，Larue H，Kelly C，et al．Evaluation of commercial ResPlex II v2.0，MultiCode-PLx，and xTAG respiratory viral panels for the diagnosis of respiratory viral infections in adults[J]．Journal of Clinical Virology，2011，50(1)：42–45．

[23] Gharabaghi F，Hawan A ，Drews S J，et al．Evaluation of multiple commercial molecular and conventional diagnostic assays for the detection of respiratory viruses in children[J]．Clinical Microbiology and Infection，2011，17(12)：1900–1906．

[24] Forman M S，Advani S，Newman C，et al．Diagnostic performance of two highly multiplexed respiratory virus assays in a pediatric cohort[J]．Journal of Clinical Virology，2012，55(2)：168–172．

[25] Pang J，Jing J，Jin P L，et al．Risk factors for febrile respiratory illness and mono-viral infections in a semiclosed military environment：A case-control study[J]. BMC Infectious Diseases，2015，15(1)：1–12．

[26] 劉忠梅，曾繁華，羅佳，等．靶序列富集多重PCR結(jié)合DHPLC同時(shí)檢測5種食源性致病菌[J]．食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2015，6(6)：2276–2281．

[27] 彭善珍．ASFV，SVDV，F(xiàn)MDV–O，PRV的Tem–PCR檢測方法的初步研究[D]．成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015．

責(zé)任編輯：王賽群英文編輯：王 庫

A review on the application of target enriched multiplex PCR

Wu Xulong1, Xiao Lu1?, Jiang Ruijiao1, Wang Yin1, 2*, Yang Zexiao1, 2, Yao Xueping1, 2, Zhang Pengfei1, Zhang Bo1
(1.College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2.Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Chengdu 611130, China)

Abstract:Target enriched multiplex PCR (Tem–PCR), a novel technology applied in molecular biology, includes three reaction stages which are enriching, tagging and amplifying by super primers. The promising Tem–PCR method solves the incompatibility and preference during amplification in routine PCR and makes pathogeny synchronous detection in one reacting system come true, hence, it gives to a new clue for researches in clinical pathogenic differential diagnosis, genotyping and resistance genes. This paper summarized the situation of commercial kits, research background and reaction principle based on the review of the applications of Tem–PCR in domestic and abroad with the purpose to provide references for further research in the field and new ideas for dealing with public health crisis.

Keywords:target enriched multiplex PCR(Tem–PCR); high-throughput; biotechnology; public health

中圖分類號(hào)：Q752

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007?1032(2016)02?0172?05

收稿日期：2015–10–09 修回日期：2016–03–02

基金項(xiàng)目：“十二·五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAD12B04)

作者簡介：鄔旭龍(1988—)，男，四川雅安人，博士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原微生物及其分子生物學(xué)研究，yaanwuxl@163.com；?并列第一作者，肖璐，碩士研究生，主要從事預(yù)防獸醫(yī)研究，yaanxiaolu@163.com；*通信作者，王印，博士，教授，主要從事動(dòng)物傳染病預(yù)防控制、傳染病病原微生物及其分子生物學(xué)研究，yaanwangyin@tom.com。