趙芳，任守文，趙為民，付言峰，李碧俠

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇 南京 210014)

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去乙?；窼IRT1過表達(dá)對豬卵巢顆粒細(xì)胞中AMPK活性的影響

趙芳，任守文，趙為民，付言峰，李碧俠*

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，江蘇 南京 210014)

摘 要：構(gòu)建豬SIRT1基因全長編碼區(qū)(coding region sequence, CDS)的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染豬原代卵巢顆粒細(xì)胞，探討SIRT1基因過表達(dá)對豬卵巢顆粒細(xì)胞中AMPK基因的轉(zhuǎn)錄及其蛋白活性的影響。測序結(jié)果表明，豬SIRT1基因的CDS區(qū)全長大小為2 229 bp，與 NCBI 發(fā)布的豬SIRT1基因 mRNA序列(EU030283.2)一致；轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1載體的顆粒細(xì)胞中SIRT1 的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平極顯著高于空載體對照組(P＜0.01)；pEGFP–C1–SIRT1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，AMPK–α1和AMPK–α2基因的 mRNA 表達(dá)量顯著高于空載體對照組，且細(xì)胞中AMPKα Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的原代豬卵巢顆粒細(xì)胞中的SIRT1基因過表達(dá)使AMPK的表達(dá)顯著增加，影響AMPK的活性，推測SIRT1可能通過AMPK在豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

關(guān) 鍵 詞：豬；卵巢顆粒細(xì)胞；沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (SIRT1)；腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)

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顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因，其分子機(jī)制仍不清楚。了解顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，對研究卵泡閉鎖、卵巢衰老具有十分重要的意義。SIRT1是一種二氫尿嘧啶脫氫酶(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的具有去乙酰化酶活性的多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)組蛋白及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的乙?；揎椝絽⑴c基因轉(zhuǎn)錄沉默[1–2]、細(xì)胞生長周期調(diào)節(jié)[3–4]以及能量代謝[5–6]。SIRT1在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7–9]，SIRT1通過線粒體凋亡信號通路參與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控，其表達(dá)升高顯著增加豬卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率[10–12]。其參與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

作為NAD+依賴的去乙酰化酶，當(dāng)SIRT1催化底物蛋白去乙酰化反應(yīng)時(shí)，NAD+被代謝生成尼克酰胺(nicotinamide，NAM)。NAM可競爭結(jié)合SIRT1上的NAD+結(jié)合位點(diǎn)，抑制SIRT1的活性[13]。SIRT1的活性受AMPK調(diào)控[14]。AMPK是真核生物中廣泛存在的能量敏感性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是由α、β、γ共3個(gè)亞單位組成的異源三聚體蛋白；α亞單位主要起催化作用，有α1和α2共2個(gè)亞型[15]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP與AMP的比值下降時(shí)，AMPK的活性增強(qiáng)。AMPK激活后可顯著上調(diào)NAMPT的表達(dá)，增加SIRT1激活因子的NAD+含量，增強(qiáng)SIRT1的活性[16]。此外，AMPK可直接對SIRT1的T344位點(diǎn)磷酸化，影響SIRT1活性[17]。目前，關(guān)于豬卵巢顆粒細(xì)胞中AMPK是否對SIRT1的活性發(fā)揮調(diào)控作用仍少見報(bào)道。本研究中通過構(gòu)建豬SIRT1基因過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的原代豬卵巢顆粒細(xì)胞，分析豬卵巢顆粒細(xì)胞中過表達(dá)SIRT1對AMPK活性的影響，旨在解析豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡過程中SIRT1/AMPK信號通路的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，了解SIRT1在豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)理。

1　材料和方法

1.1材料

試驗(yàn)豬由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合蘇鐘豬原種場提供。采集20～30個(gè)新鮮健康的豬卵巢，置于37℃生理鹽水(添加青霉素和鏈霉素)中，2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2試劑

新生胎牛血清、胰蛋白酶(Trypsin)、DMEM–F12液體培養(yǎng)基購自GIBCO公司；Trizol、Lipofecta mine 2000購自Invitrogen公司；高保真DNA聚合酶、DNA Marker、SYBR Premix Ex TaqTM、SalI、BamHI 酶購自TaKaRa公司；M– MLV Reverse Transcriptase購自FERMENTAS公司；Western Blot蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；Phospho–AMPKα(Thr172)抗體購自Cell Signaling公司；Anti–SIRT1抗體購自Abcam公司；β–actin兔抗多克隆抗體、HRP–山羊抗兔IgG和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自博士德生物工程有限公司；其他試劑自行配制。

1.3方法

1.3.1豬卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

將采集的新鮮豬卵巢用生理鹽水沖洗，用一次性注射器抽取健康卵泡的卵泡液，1 000×g離心4 min，收集細(xì)胞；加入適量PBS懸浮液并清洗細(xì)胞；吸取適量細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸浮，將細(xì)胞密度調(diào)整至106/mL，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶加3 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，并做相應(yīng)標(biāo)記，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h后觀察細(xì)胞貼壁狀況，24 h后換液。pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，用熒光定量PCR檢測SIRT1、AMPK–α1 和AMPK–α2在試驗(yàn)組和空載對照組中的mRNA表達(dá)量。pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞36 h，收集細(xì)胞，采用Western Blot方法檢測SIRT1的蛋白表達(dá)水平及Phospho–AMPKα (Thr172)蛋白的表達(dá)水平。

1.3.2 重組質(zhì)粒pEGFP–C1–SIRT1的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中公布的豬SIRT1基因序列，設(shè)計(jì)并合成PCR引物SIRT1–F(ACGCGTCGAC GCAGTT GAAAGATGGCGGAC，斜線部分為保護(hù)堿基，劃線部分為酶切位點(diǎn))和SIRT1–R(CGCGGATCC CCTTTCTGGTTTCCTTGCGC)。引物由上海英駿生物公司合成，擴(kuò)增片段大小為2 230 bp。以豬卵巢組織cDNA為模板，用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增SIRT1基因的全長編碼區(qū)序列，將SIRT1基因片段插入到用SalI/BamHI 雙酶切處理的載體pEGFP–C1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP–C1–SIRT1。

1.3.3 pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒在豬卵巢顆粒細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的檢測

用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取的重組質(zhì)粒pEGFP–C1–SIRT1以3 μg/孔轉(zhuǎn)染六孔板培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的顆粒細(xì)胞為陰性對照；轉(zhuǎn)染24 h時(shí)進(jìn)行熒光顯微鏡檢測，并收集細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR檢測；轉(zhuǎn)染36 h 時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行Western Blot分析。

1.3.4熒光定量PCR檢測

根據(jù)GenBank中公布的豬SIRT1、GAPDH、AMPK–α1、AMPK–α2基因序列設(shè)計(jì)引物，引物由上海英駿生物工程技術(shù)公司合成(表1)。TrizoL法提取豬卵巢顆粒細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR擴(kuò)增。目的基因、管家基因熒光定量PCR反應(yīng)總體積為25.0 μL，其中SYBR premixes Taq TM 12.5 μL，上、下游正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板1 μL，去離子水10.5 μL。設(shè)無模板對照。采用2步法，反應(yīng)條件均為94 ℃預(yù)變性10 s；94 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 s。

表1　熒光定量PCR引物序列Table 1　Primer sequences used in quantitative real-time PCR

1.3.5Western Blot檢測相關(guān)蛋白的濃度

按照碧云天Western Blot 細(xì)胞裂解液說明書提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取的總蛋白濃度。

1) 電泳。50～100 μg 的蛋白樣品通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。

2) 轉(zhuǎn)膜。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Bio Rad)，轉(zhuǎn)膜完成后將膜取出，放入到TBS–T中清洗1次，清洗時(shí)間為10 min。

3) 封閉。用TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后室溫放置2 h。

4) 一抗孵育。分別加入 Phospho–AMPKα (Thr172)(1∶1 000)和 Anti–SIRT1 antibody (1∶3 000)，4 ℃過夜孵育；孵育結(jié)束后用TBS–T清洗3次，每次10 min。

5) 二抗孵育。用封閉液稀釋HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1∶3 000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育3 h；孵育結(jié)束后用TBS–T清洗3次，每次10 min。

6) DAB顯色。使用DAB顯色試劑盒經(jīng)適當(dāng)顯色后，用水終止顯色。內(nèi)參采用β–actin。采用Gel–ProAnalyzer 4.0軟件分析蛋白條帶積分吸光度值。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用相對定量2–ΔΔCt方法計(jì)算SIRT1 基因的表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因，ΔCt = Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因。ΔΔCt＝(Ct處理組目的基因－Ct處理組內(nèi)參基因)－(Ct未處理組目的基因－Ct未處理組內(nèi)參基因)。2–ΔΔCt表示試驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。用SPSS 16.0軟件對豬卵巢顆粒細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行單因子方差分析和LSD多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pEGFP–C1–SIRT1的構(gòu)建結(jié)果

利用引物SIRT1–F和SIRT1–R，以豬卵巢組織cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增豬全長SIRT1基因編碼區(qū)，通過瓊脂糖凝膠電泳，檢測到1條長約2 230 bp的特異性條帶(圖1–A)，該片段大小與預(yù)期的SIRT1基因全長編碼區(qū)大小一致。將該目的片段進(jìn)一步亞克隆到pEGFP–C1 vector載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP– C1–SIRT1。pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶SalI、BamHI雙酶切后，得到與目的片段大小一致的片段(圖1–B)。測序分析結(jié)果表明，所測克隆序列與NCBI中發(fā)布的SIRT1基因CDS區(qū)的堿基序列一致。

圖1　豬SIRT1基因真核表達(dá)載體pEGFP–C1–SIRT1構(gòu)建的電泳檢測結(jié)果Fig.1 Construction result of the eukaryotic expression vector pEGFP–C1–SIRT1 detected by electrophoresis

2.2pEGFP–C1– SIRT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬卵巢顆粒細(xì)胞的效果

利用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofecta mine?2000 將表達(dá)綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pEGFP–C1–SIRT1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染豬原代卵巢顆粒細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染24 h 時(shí)用熒光顯微鏡檢測到的轉(zhuǎn)染效果(圖2)表明，在部分豬原代卵巢顆粒細(xì)胞中檢測到綠色熒光，說明pEGFP– C1–SIRT1質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)染到豬原代卵巢顆粒細(xì)胞中。

圖2　熒光顯微鏡檢測豬卵巢顆粒細(xì)胞中pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果Fig.2 Transfection efficiency of pEGFP–C1–SIRT1 detected from fluorescence microscopy in porcine granulosa cells

2.3轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1后豬卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)變化

熒光定量PCR結(jié)果表明，對照組、試驗(yàn)組的SIRT1 mRNA的相對表達(dá)量分別為0.032 0±0.005 9和0.008 6±0.002 3，試驗(yàn)組是對照組的3.65倍，二者差異極顯著(P<0.01)。Western Blot結(jié)果(圖3)表明，與空載對照組相比，試驗(yàn)組SIRT1蛋白的表達(dá)量顯著升高?；叶戎捣治鼋Y(jié)果表明，對照組、試驗(yàn)組的SIRT1蛋白表達(dá)量分別為0.77±0.10和1.94±0.18，試驗(yàn)組是對照組的2.5倍，差異極顯著(P<0.01)。

圖3　轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1后豬卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達(dá)量Fig.3 Protein SIRT1 expression in porcine granulosa cells after pEGFP–C1–SIRT1 plasmid transfected

2.4轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒對顆粒細(xì)胞中AMPK轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果(表2)表明，轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒后，AMPK–α1 mRNA的相對表達(dá)水平升高，為對照組的3倍，差異極顯著(P<0.01)；相對于對照組，試驗(yàn)組AMPK–α2 mRNA的相對表達(dá)水平升高，約為對照組的2倍，差異顯著(P<0.05)。

表2　轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒后豬顆粒細(xì)胞中AMPK–α1與AMPK–α2 mRNA的相對表達(dá)量Table 2　Relative expression of AMPK–α1, AMPK–α2 mRNA detected from real-time PCR after pEGFP–C1–SIRT1 plasmid transfected

2.5轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1質(zhì)粒對顆粒細(xì)胞中AMPK活性的影響

Western Blot檢測結(jié)果(圖4)表明，相對于空載對照組，試驗(yàn)組AMPKα 蛋白Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平顯著升高，試驗(yàn)組、對照組灰度值分析結(jié)果分別為1.66±0.13、0.74±0.09，其組間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

圖4　Western Blot檢測轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1后顆粒細(xì)胞中AMPKα Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平Fig.4 Expression of Phospho–AMPKα (Thr172) protein detected from Western Blot in porcine granulosa cells after pEGFP–C1–SIRT1 plasmid transfected

3　結(jié)論與討論

SIRT1是NAD+依賴的去乙?；福谀芰看x和細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。晚期閉鎖卵泡中SIRT1的表達(dá)量顯著高于早期閉鎖卵泡和健康卵泡。SIRT1激活劑白藜蘆醇能顯著加速顆粒細(xì)胞的凋亡，而SIRT1的抑制劑尼克酰胺則顯著抑制顆粒細(xì)胞凋亡[11–12]。SIRT1通過線粒體凋亡信號通路參與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控[10]。為了進(jìn)一步闡明SIRT1參與顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建了豬SIRT1基因的真核表達(dá)載體pEGFP–C1–SIRT1，將其轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的原代豬卵巢顆粒細(xì)胞，分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平對SIRT1基因的過表達(dá)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pEGFP–C1–SIRT1后，顆粒細(xì)胞中SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，說明pEGFP–C1–SIRT1能有效過表達(dá)SIRT1基因。

AMPK–α1和AMPK–α2 mRNA表達(dá)水平的升高可能與AMPK的活性密切相關(guān)[15]。AMPK的激活與其Thr172 位點(diǎn)磷酸化密切相關(guān)，無論是α、β、γ亞基形成的AMPK復(fù)合物，還是單獨(dú)的α激酶結(jié)構(gòu)域，都需要Thr172 位點(diǎn)磷酸化才具有激酶活性[18]。通過比較pEGFP–C1–SIRT1轉(zhuǎn)染組和空載對照組，發(fā)現(xiàn)豬卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1的過表達(dá)均引起了AMPK–α1和AMPK–α2 mRNA表達(dá)水平升高。Western Blot檢測結(jié)果表明，相對于空載對照組，pEGFP–C1–SIRT1轉(zhuǎn)染組AMPK–α Thr172位點(diǎn)的磷酸化水平升高。這可能暗示豬卵巢顆粒細(xì)胞中SIRT1過表達(dá)激活了AMPK活性。

AMPK和SIRT1間存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)關(guān)系，SIRT1可使AMPK上游激酶LKB去乙?；?，激活A(yù)MPK[19–20]。AMPK激活后可顯著上調(diào)NAMPT表達(dá)，增加SIRT1激活因子的NAD+含量，增強(qiáng)SIRT1活性[16,21]；AMPK還可以直接對SIRT1的T344位點(diǎn)磷酸化，影響SIRT1活性，改變細(xì)胞的能量狀態(tài)[17,22]。AMPK的激活顯著影響卵巢顆粒細(xì)胞增殖。當(dāng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中雙氫睪酮激活A(yù)MPK后，ERK信號通路被抑制，F(xiàn)SH刺激的顆粒細(xì)胞增殖降低[23]；FSH通過Akt信號通路抑制AMPK的激活，促進(jìn)原始顆粒細(xì)胞增殖[24]。在牛的卵巢顆粒細(xì)胞中，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK，抑制IGF1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和蛋白合成[25]。SIRT1表達(dá)升高抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞增殖，促使其凋亡。本研究中發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達(dá)顯著上調(diào)AMPK表達(dá)，促進(jìn)Thr172 位點(diǎn)磷酸化，因此，SIRT1表達(dá)上調(diào)可能引起AMPK活性增強(qiáng)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，暗示AMPK激活在顆粒細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵調(diào)控作用。AMPK的下游底物極其廣泛，SIRT1/AMPK激活調(diào)控豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制有待研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Brunet A，Sweeney L B，Sturgill J F，et al. Stressdependent regulation of FOXO transcription factors by the SIRT1 deacetylase[J]．Science，2004，303(5666)：2011–2015．

[2] Nemoto S，F(xiàn)ergusson M M，F(xiàn)inkel T．SIRT1 functionally interacts with the metabolic regulator and transcriptional coactivator PGC–1α[J]．J Biol Chem，2005，280(16)：16456–16460．

[3] Zhang Y，Zhang M，Dong H，et al．Deacetylation of cortactin by SIRT1 promotes cell migration[J]. Oncogene，2009，28(3)：445–460．

[4] Sasaki T，Maier B，Bartke A，et al．Progressive loss of SIRT1 with cell cycle withdrawal[J]．Aging Cell，2006，5(5)：413–422．

[5] Cohen DE，Supinski AM，Bonkowski MS，et al．Neuronal SIRT1 regulates endocrine and behavioral responses to calorie restriction[J]．Genes Dev，2009，23(24)：2812–2817．

[6] Satoh A，Brace CS，Ben-Josef G，et al．SIRT1 promotes the central adaptive response to diet restriction through activation of the dorsomedial and lateral nuclei of the Hypothalamus[J]．Journal of Neuroscience，2010，30(30)：10220–10232．

[7] Wang W，Yan C，Zhang J，et al．SIRT1 inhibits TNF–alpha–induced apoptosis of vascular adventitial fibroblasts partly through the deacetylation of FoxO1[J].Apoptosis，2013：689–701.

[8] Wang D，Hu Z，Hao J，et al．SIRT1 inhibits apoptosis of degenerative human disc nucleus pulposus cells through activation of Akt pathway[J]．Age (Dordr)，2013，35(3)：1741–1753.

[9] Feng X，Liang N，Zhu D，et al．Resveratrol inhibits beta-amyloid-induced neuronal apoptosis through regulation of SIRT1–ROCK1 signaling pathway[J]．PLoS One，2013，8(3)：e59888．

[10] Zhao F，Zhao W，Ren S，et al．Roles of SIRT1 in granulosa cell apoptosis during the process of follicular atresia in porcine ovary[J]．Anim Reprod Sci，2014，151(1/2)：34–41．

[11] 李碧俠，趙芳，任守文，等．白黎蘆醇誘導(dǎo)的去乙酰化酶 SIRT1 高表達(dá)對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響[J]．中國畜牧雜志，2013，49(3)：69–71．

[12] 趙芳，郅西柱，任守文，等．SIRT1基因?qū)ωi卵巢顆粒細(xì)胞凋亡因子表達(dá)量的影響[J]．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30(2)：325–330．

[13] Vaziri H，Dessain S K，Ng Eaton E，et al．hSIR2(SIRT1) functions as an NAD–dependent p53 deacetylase[J]. Cell，2001，107(2)：149–159．

[14] Nin V，Escande C，Chini C C，et al．Role of deleted in breast cancer 1 (DBC1) protein in SIRT1 deacetylase activation induced by protein kinase A and AMP–activated protein kinase[J]．J Biol Chem，2012，287(28)：23489–23501．

[15] Hardie D G，Ross F A，Hawley S A．AMPK：A nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(4)：251–262．

[16] Canto C，Gerhart-Hines Z，F(xiàn)eige J N，et al．AMPK regulates energy expenditure by modulating NAD+metabolism and SIRT1 activity[J]．Nature，2009，458(7241)：1056–1060．

[17] Lau AW，Liu P，Inuzuka H，et al．SIRT1 phosphorylation by AMP–activated protein kinase regulates p53 acetylation[J]．Am J Cancer Res，2014，4(3)：245–255．

[18] Hudson E R，Pan D A，James J，et al．A novel domain in AMP-activated protein kinase causes glycogen storage bodies similar to those seen in hereditary cardiac arrhythmias[J]．Curr Biol，2003，13(10)：861–866．

[19] Yoneda M，Guo Y，Ono H，et al．Decreased SIRT1 expression and LKB1 phosphorylation occur with long-term high-fat diet feeding，in addition to AMPK phosphorylation impairment in the early phase[J]．Obes Res Clin Pract，2010，4(3)：e163–246．

[20] Zheng Z，Chen H，Li J，et al．Sirtuin 1–mediated cellular metabolic memory of high glucose via the LKB1/AMPK/ ROS pathway and therapeutic effects of metfor min[J]. Diabetes，2012，61(1)：217–228．

[21] Fulco M，Cen Y，Zhao P，et al．Glucose restriction inhibits skeletal myoblast differentiation by activating SIRT1 through AMPK-mediated regulation of Nampt[J]. Dev Cell，2008，14(5)：661–673．

[22] Narala S R，Allsopp R C，Wells T B，et al．SIRT1 acts as a nutrient-sensitive growth suppressor and its loss is associated with increased AMPK and telomerase activity[J]. Mol Biol Cell，2008，19(3)：1210–1219．

[23] Kayampilly P P，Menon K M．AMPK activation by dihydrotestosterone reduces FSH-stimulated cell proliferation in rat granulosa cells by inhibiting ERK signaling pathway[J]．Endocrinology，2012，153(6)：2831–2838．

[24] Kayampilly P P，Menon K M．Follicle-stimulating hormone inhibits adenosine 5'-monophosphate-activated protein kinase activation and promotes cell proliferation of primary granulosa cells in culture through an Akt–dependent pathway[J]．Endocrinology，2009，150 (2)：929–935．

[25] Tosca L，Rame C，Chabrolle C，et al．Metfor min decreases IGF1-induced cell proliferation and protein synthesis through AMP-activated protein kinase in cultured bovine granulosa cells[J]．Reproduction，2010，139(2)：409–418．

責(zé)任編輯：王賽群英文編輯：王 庫

Effect of the overexpression from deacetylase gene SIRT1 on AMPK activity in porcine granulosa cells

Zhao Fang, Ren Shouwen, Zhao Weimin, Fu Yanfeng, Li Bixia*
(Institute of Animal Husbandry, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Jiangsu Germplasm Resources Protection and Utilization Platform, Nanjing 210014, China)

Abstract:A eukaryotic expression vector of full-length gene SIRT1 was constructed and transfected into porcine primary ovary granulosa cells for investigating the effects of overexpression from gene SIRT1 on AMPK mRNA expression and its activity. The results showed that the full-length coding sequence of porcine gene SIRT1 was identical to NCBI reference sequence (EU030283.2), it had 2 229 bp. Both mRNA and protein expression level of gene SIRT1 were significantly increased in the group transfected with pEGFP–C1–SIRT1 (P<0.01). The mRNA expression of AMPK–α1 and AMPK–α2 were both significantly increased, so did the phosphorylation level at Thr172 sites in AMPKα (P<0.05). The overexpression of gene SIRT1 was significantly increased the AMPK expression and its activity in ovarian granulosa cells via in vitro cultured from primary porcine. These results suggested that SIRT1 might play an important role in regulating the apoptosis of porcine granulosa cell through activating AMPK.

Keywords:porcine; ovary granulosa cell; silent information regulator 1 (SIRT1); AMP-activated protein kinase (AMPK)

中圖分類號：S828.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007?1032(2016)02?0166?06

收稿日期：2015–09–15 修回日期：2016–03–03

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD03B01–08)；國家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS–36)；江蘇省自主創(chuàng)新項(xiàng)目(CX(14)2069)；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研專項(xiàng)(ZX(15)5002)

作者簡介：趙芳(1985—)，女，山東桓臺人，碩士，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究，zanzi006@163.com；*通信作者，李碧俠，副研究員，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究，bxli790@ sina.com