房雅楠，隋汝波，張　磊

(錦州醫(yī)科大學(xué)：1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州　121001；2. 護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州　121000)

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◇中醫(yī)藥研究◇

針刺完骨穴對(duì)血管性癡呆大鼠海馬炎性細(xì)胞因子的影響

房雅楠1，隋汝波1，張磊2

(錦州醫(yī)科大學(xué)：1. 附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州121001；2. 護(hù)理學(xué)院，遼寧錦州121000)

摘要：目的探討針刺完骨穴(GB 12)對(duì)血管性癡呆大鼠海馬炎性細(xì)胞因子的影響，為針刺治療血管性癡呆提供理論依據(jù)。方法選用健康SD大鼠(n=54，300～450 g)，隨機(jī)分為假手術(shù)組、血管性癡呆組、針刺組，進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分并測(cè)定海馬炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA的表達(dá)，HE染色觀察海馬組織變化。結(jié)果與血管性癡呆組相比，針刺組大鼠學(xué)習(xí)能力顯著提升且炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA表達(dá)下降；同時(shí)，海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷程度下降，其形態(tài)學(xué)恢復(fù)到接近正常。結(jié)論電針完骨穴可以降低海馬炎性細(xì)胞因子水平，降低神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，為血管性癡呆提供了新的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

關(guān)鍵詞：血管性癡呆(VD)；海馬；細(xì)胞因子；針刺；完骨穴；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；白細(xì)胞介素-6(IL-6)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)

血管性癡呆(vascular dementia, VD)是卒中后常見并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)20%～33%[1]。卒中1年后VD損傷的發(fā)生率達(dá)70%。伴有VD的卒中患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降并且有著極高的致死率。目前，雖然對(duì)于VD治療的研究方法很多，但是其發(fā)生機(jī)制仍尚未闡明[2]。神經(jīng)生物化學(xué)研究、細(xì)胞和分子機(jī)制研究都報(bào)道了VD患者學(xué)習(xí)記憶受損與海馬區(qū)神經(jīng)元變性、壞死、凋亡關(guān)系密切[3-5]，研究人員提出了神經(jīng)解剖學(xué)的假說。此外，異常的細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害在卒中后認(rèn)知障礙中占有重要作用[6-8]。BATTI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可能影響大鼠海馬在突觸傳遞過程中氧的恢復(fù)。 ZULIANI等[10]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VD患者細(xì)胞因子水平的顯著增加，證明了細(xì)胞因子和VD的嚴(yán)重程度之間有著很強(qiáng)相關(guān)性。還有許多方法已被用于治療，但很少有藥物有效。本實(shí)驗(yàn)建立VD大鼠模型，探討針刺完骨穴(GB 12)對(duì)VD大鼠海馬細(xì)胞因子的影響，為針刺治療VD提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用成年雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量300～450 g。給予大鼠自由飲水和進(jìn)食，白天和夜晚各12 h的睡眠、活動(dòng)時(shí)間。

1.2大腦中動(dòng)脈結(jié)扎模型(MCAO)的制作及成功評(píng)分大鼠腹腔注射40 g/L水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。頸部正中切開后，鈍性分離周圍組織，暴露左頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和迷走神經(jīng)。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA。距CCA分叉處近心端0.5 cm處將CCA剪一小口，插入肝素化的燒頭尼龍線從CCA沿著ICA推進(jìn)，使進(jìn)入ICA的尼龍線從CCA分叉處到MCA大約18 mm左右，有效地阻斷了MCA血流，結(jié)扎CCA并固定尼龍線。模型評(píng)價(jià)為：0分即無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分即不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分即向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分即向?qū)?cè)傾倒；4分即不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分即死亡。

1.3分組及針刺穴位刺激干預(yù)54只雄性大鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為假手術(shù)組、血管性癡呆組(VD組)、針刺組，每組18只。VD組僅行MCAO手術(shù)；假手術(shù)組則將進(jìn)入ICA的尼龍線從CCA分叉處到大腦中動(dòng)脈(MCA)大約10 mm左右時(shí)，結(jié)扎CCA并固定尼龍線(不能抵達(dá)MCA，即不能有效阻斷MCA血流)；電針組行MCAO手術(shù)并應(yīng)用電子針灸針(蘇州華佗醫(yī)療電針儀SDZ-Ⅱ)進(jìn)行電針刺激。完骨穴的定位根據(jù)文獻(xiàn)[11]描述(解剖位置：耳后的后下和乳突區(qū)，深度：0.3～0.5 cm)。參數(shù)如下：方波30 Hz，密波100 Hz，強(qiáng)度6～15 V。肢體輕微震動(dòng)表明針刺成功. 每次刺激20 min，1次/d，持續(xù)4月。

1.4Morris水迷宮進(jìn)行定位航行試驗(yàn)[12]白色圓形水池直徑為120 cm，高60 cm，平臺(tái)高40 cm，平臺(tái)直徑10 cm。水池等分4個(gè)象限，任一象限放置平臺(tái)。水深42 cm，加入奶粉使水顯乳白色。各組大鼠每天上午、下午各訓(xùn)練1次，連續(xù)2周。90 s仍未找到平臺(tái)者，則將其放置于平臺(tái)上站立10 s，第2周至第4周每間隔1 d后，上午將大鼠從平臺(tái)正對(duì)的象限入水，測(cè)定每只大鼠學(xué)習(xí)能力，觀察指標(biāo)為：觀察90 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間(上臺(tái)潛伏期)。

1.5Real-time PCR檢測(cè)腦組織炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)在進(jìn)行2月、4月的電針刺激后，處死并分離大鼠腦組織(根據(jù)大鼠腦圖譜)，留取部分海馬組織(備作HE染色)后，Trizol提取大鼠海馬組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：IL-1β和TNF-α循環(huán)參數(shù)為95 ℃活化TaqDNA聚合酶5 min后，95 ℃變性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃延伸20 s的循環(huán)共40次；IL-6循環(huán)參數(shù)為95 ℃活化TaqDNA聚合酶5 min后，進(jìn)行95 ℃變性10 s→64 ℃退火30 s→72 ℃延伸25 s的循環(huán)共40次。

1.6HE染色觀察海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)變化在立體定向儀上留取海馬CA1區(qū)并制作腦組織石蠟切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察。

2結(jié)果

2.1大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果VD組平均逃避潛伏期為(37.01±7.69)s，與假手術(shù)組的(12.89±4.73)s相比，明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，說明VD組SD大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶功能受損。而針刺組大鼠平均逃避潛伏期為(28.19±7.18)s，較VD組明顯縮短(P<0.05)，但與假手術(shù)組相比仍有延長(zhǎng)(P<0.05)。

2.2電針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4月后的海馬HE染色顯示，正常的神經(jīng)細(xì)胞相對(duì)較圓而且邊界清晰；受損的神經(jīng)細(xì)胞腫脹而且不對(duì)稱，或核聚集、深染。所有受損的神經(jīng)細(xì)胞都呈三角形；VD組神經(jīng)細(xì)胞受損最明顯，細(xì)胞腫脹而且不對(duì)稱，呈三角形；電針組細(xì)胞水腫較輕，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)接近正常，數(shù)量增加(圖1)。

2.3TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)情況將提取出的大鼠海馬組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，通過PCR對(duì)TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，VD組的TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表達(dá)比假手術(shù)組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第2月P<0.01，第4月P<0.01)，針刺組各炎性因子的mRNA表達(dá)比VD組低(第2月P<0.05，第4月P<0.01，圖2)。

圖1各組海馬CA1區(qū)域中神經(jīng)細(xì)胞的變化

Fig.1 Changes in nerve cells in the hippocampal CA1 region in each group (HE, ×400)

A：假手術(shù)組，箭頭所示為正常的神經(jīng)細(xì)胞；B：VD組，箭頭所示為受損的神經(jīng)細(xì)胞；C：針刺組，箭頭所示為損壞的神經(jīng)細(xì)胞。

圖2各組大鼠第2月和第4月海馬組織中TNF-α、IL-6 、IL-1β mRNA的表達(dá)情況

Fig.2 The mRNA expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β in the hippocampal tissues at months 2 and 4, respectively

與假手術(shù)組第2月相比，△P<0.01；與假手術(shù)組第4月相比，#P<0.01；與VD組第2月相比，*P<0.05；與VD組第4月相比，□P<0.01。

3討論

隨著社會(huì)的老齡化，VD已成為日益嚴(yán)重的社會(huì)問題。迄今為止已有很多關(guān)于VD的理論，但其發(fā)病機(jī)制仍不清，重要的研究有神經(jīng)解剖學(xué)假說和異常的細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害作用[6-8]。最近的研究表明，VD組不僅炎性細(xì)胞因子增加而且受損的神經(jīng)細(xì)胞也增加。另有研究表明，適當(dāng)電治療可以通過神經(jīng)調(diào)節(jié)增加缺血腦組織的血流量而保護(hù)腦組織[13]。因此，本研究檢測(cè)了VD大鼠及針刺完骨穴治療時(shí)，其學(xué)習(xí)記憶能力的變化及炎性細(xì)胞因子在海馬組織的表達(dá)。結(jié)果表明，針刺完骨穴顯著降低了VD大鼠逃避潛伏期，提示針刺完骨穴可以改善VD大鼠學(xué)習(xí)能力，為臨床治療VD提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究進(jìn)一步檢測(cè)海馬炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA的表達(dá)變化并觀察VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的病理學(xué)變化。結(jié)果表明，針刺組大鼠學(xué)習(xí)能力較VD組顯著提升，且炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)mRNA表達(dá)下降。同時(shí)，海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷程度下降，其形態(tài)學(xué)恢復(fù)到接近正常。國(guó)外NI等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小腦頂核損害加速胸腺細(xì)胞分化為成熟的T輔助淋巴細(xì)胞，并能提高外圍免疫組織的T輔助淋巴細(xì)胞的功能，提示免疫系統(tǒng)由小腦頂核大幅調(diào)節(jié)。有研究也有類似結(jié)果，電刺激小腦頂核不僅抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖，而且可減輕伴有缺血缺氧腦損傷新生大鼠的星形細(xì)胞結(jié)構(gòu)損害[15]。因此，本研究針刺完骨穴時(shí)，觀察到可穩(wěn)定細(xì)胞因子，降低海馬損傷，增進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力，其可能與針刺小腦頂核(完骨穴位)使免疫系統(tǒng)抑制，防止炎性細(xì)胞因子過度產(chǎn)生有關(guān)。這可能為探索VD的發(fā)病機(jī)制和選擇治療目標(biāo)提供了新的途徑。但是，觀察炎性細(xì)胞因子變化的時(shí)間相對(duì)較短，也沒有觀察細(xì)胞因子對(duì)于海馬長(zhǎng)期的影響。這尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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(編輯國(guó)榮)

收稿日期：2015-10-09修回日期：2016-01-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81241050；No.81371461)

通訊作者：張磊. E-mail: 264437699@qq.com；隋汝波. E-mail: suirubo521@aliyun.com

中圖分類號(hào)：R741

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604024

Electroacupuncture at the Wangu acupoint suppresses expression of inflammatory cytokines in the hippocampus of rats with vascular dementia

FANG Ya-nan1, SUI Ru-bo1, ZHANG Lei2

(1. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001; 2. Department of Nursing, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo examine whether electroacupuncture at the Wangu acupoint (GB 12), whose position is similar to the cerebellar fastigial nucleus, can reduce inflammatory cytokines in the hippocampus of rats with vascular dementia (VD) to provide theoretical evidence for treating VD with electroacupuncture. MethodsHealthy Sprague-Dawley rats (n=54, 300-450 g) were randomly divided into three groups: sham surgery group, VD group, and electroacupuncture group. The ethologic scores of VD rats were evaluated and the mRNA expressions of inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-1β) in the hippocampus were assessed and the hippocampal tissues were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. ResultsCompared with VD group, in electroacupuncture group the rats’ learning ability improved significantly and the mRNA expressions of TNF-α, IL-6 and IL-1β decreased. Simultaneously, the damage extent of nerve cells in the hippocampal tissues decreased, and their morphology recovered to nearly normal. ConclusionElectroacupuncture at the Wangu acupoint can decrease the level of inflammatory cytokines in the hippocampus and reduce the damage extent of nerve cells in the hippocampus, thus providing a new neuroprotective method for VD.

KEY WORDS:vascular dementia (VD); hippocampus; cytokine; electroacupuncture; Wangu acupoint; TNF-α; IL-6; IL-1β

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81241050 and 81371461)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.r.20160412.1722.002.html(2016-04-12)