嚴(yán)貴忠，王登峰，楊文楨，劉吉星，侯博儒，任海軍

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅蘭州　730030)

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◇基礎(chǔ)研究◇

熱休克蛋白70對小鼠顱腦創(chuàng)傷相關(guān)急性胃黏膜病變的保護(hù)作用

嚴(yán)貴忠，王登峰，楊文楨，劉吉星，侯博儒，任海軍

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅蘭州730030)

摘要：目的探索熱休克蛋白70(HSP70)在小鼠顱腦創(chuàng)傷急性胃黏膜病變模型中的保護(hù)作用機(jī)制。方法40只成年雄性小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、模型組+GGA組(C組)、模型組+生理鹽水對照組(D組)。模型制作采用Feeney改良方法制成顱腦創(chuàng)傷急性胃黏膜病變模型；C組同時給予HSP70誘導(dǎo)劑GGA(geranylgeranylacetone，800 mg/kg)灌胃。分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、TUNEL法檢測小鼠腦組織及胃黏膜內(nèi)HSP70的表達(dá)和細(xì)胞凋亡。結(jié)果B組小鼠腦組織挫傷及胃黏膜損傷范圍大于A、C組(P<0.05)。B組小鼠腦組織及胃黏膜內(nèi)HSP70的表達(dá)均有不同程度的升高，高于A組(P<0.05)；B、D組腦組織和胃黏膜內(nèi)細(xì)胞凋亡最明顯，明顯高于A、C組(P<0.05)；經(jīng)GGA灌胃后HSP70蛋白表達(dá)明顯升高，而細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，C組的HSP70表達(dá)高于B、D組，而細(xì)胞凋亡指數(shù)低于B、D組(P<0.05)。結(jié)論GGA灌胃后能夠誘導(dǎo)HSP70在腦組織和胃黏膜內(nèi)的表達(dá)；抑制細(xì)胞凋亡途徑是HSP70保護(hù)腦組織和胃黏膜的機(jī)制之一；GGA可以用于顱腦創(chuàng)傷急性胃黏膜病變的預(yù)防和治療。

關(guān)鍵詞：顱腦創(chuàng)傷；急性胃黏膜病變；熱休克蛋白70(HSP70)；細(xì)胞凋亡

急性胃黏膜病變?yōu)轱B腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury, TBI)后發(fā)生率較高的嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[1]。熱休克蛋白的表達(dá)是機(jī)體在應(yīng)激情況下，發(fā)揮防御保護(hù)的重要機(jī)制之一[2]。早期的研究證實，GGA(geranylgeranylacetone)可以誘導(dǎo)HSP70在胃腸黏膜、肝臟、心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織中表達(dá)[3]。通過研究GGA誘導(dǎo)HSP70在顱腦創(chuàng)傷急性胃黏膜病變模型中小鼠腦組織和胃黏膜內(nèi)的表達(dá)變化，探討HSP70在應(yīng)激狀態(tài)下的保護(hù)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組健康清潔級雄性小鼠，體質(zhì)量約18～22 g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。將40只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、模型組+GGA組(C組)、模型組+生理鹽水組(D組)，每組10只。

模型為顱腦創(chuàng)傷急性胃黏膜病變模型，采用Feeney改良方法制作。小鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，固定頭部后，在右側(cè)頂部磨直徑約4 mm的骨窗，骨窗前緣距冠狀縫1 mm，內(nèi)側(cè)緣距中線1 mm，保持硬腦膜完整，將40 g的打擊錘從20 cm高處自由落下打擊骨窗。C組小鼠在建模前1 d，GGA(800 mg/kg，Sigma公司，美國)灌胃給藥；D組以等體積的無菌鹽水灌胃作為對照組。

1.2標(biāo)本取材及病理觀察建模6 h，戊巴比妥腹腔麻醉各組大鼠，40 g/L多聚甲醛全身灌注后取出大腦和胃組織，觀察腦組織發(fā)生挫裂傷、出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血的程度，并固定在40 g/L多聚甲醛中，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5 μm厚度連續(xù)切片，常溫保存，部分常規(guī)進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色并觀察病理改變；部分進(jìn)行免疫組化、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測分析。

1.3免疫組化染色按HSP70免疫組化試劑盒(Affinity公司,美國 )說明書操作。將制備好的腦及胃組織切片脫蠟去水，內(nèi)源性過氧化物酶封閉，高溫抗原修復(fù)，依此滴加羊血清、兔抗HSP70抗體(1∶100)，常溫結(jié)合1 h，生物素標(biāo)記羊抗兔IgG室溫15 min，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素室溫15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。每張玻片隨機(jī)取5個視野，OlymPus FSX100顯微鏡捕捉圖片，用Image J圖像分析軟件分析陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)。

1.4TUNEL檢測細(xì)胞凋亡按TUNEL試劑盒(七海生物公司，上海)說明操作。切片脫蠟去水，蛋白酶K增加細(xì)胞通透性，滴加FITC-標(biāo)記反應(yīng)混合物和TdT酶組成的反應(yīng)液，室溫孵育90 min，滴加PI染色液，在暗室中放置5 min。熒光顯微鏡下分析樣本，并統(tǒng)計凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率。

2結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)改變小鼠腦組織均觀察到明顯的挫裂傷、出血及蛛網(wǎng)膜下腔出血；胃黏膜HE染色可見炎性細(xì)胞浸潤、黏膜脫落、出血等改變。證明顱腦創(chuàng)傷急性胃黏膜病變造模成功(圖1)。

圖1小鼠大腦半球可見挫傷及廣泛性蛛網(wǎng)膜下腔出血(A)和小鼠胃黏膜HE染色可見炎性細(xì)胞浸潤和黏膜脫落(B)

Fig.1 Gross view of the contusion and extensive subarachnoid hemorrhage in mouse brain hemisphere (A) and HE staining view of the inflammatory cell infiltration and mucosal shedding in mice gastric mucosa (B)

2.2HSP70在應(yīng)激時的改變免疫組化標(biāo)記后，HSP70陽性部位位于胞質(zhì)；腦組織內(nèi)廣泛表達(dá)，包括丘腦、海馬等部位；胃內(nèi)以胃腺部最明顯。造模后腦組織及胃黏膜組織HSP70蛋白的表達(dá)均有不同程度的升高，B、D組小鼠腦組織和胃黏膜組織HSP70表達(dá)明顯高于A組(P<0.05，圖2、圖3)。

2.3TBI引起的細(xì)胞凋亡TUNEL標(biāo)記凋亡細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，腦組織內(nèi)凋亡細(xì)胞主要聚集在損傷灶局部；胃黏膜凋亡細(xì)胞廣泛存在，無明顯的特異性部位。B、D組腦組織和胃黏膜組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生最明顯，明顯高于A、C組(P<0.05)。

2.4GGA對HSP70及細(xì)胞凋亡的影響C組小鼠經(jīng)GGA灌胃后，在腦組織和胃黏膜組織均可檢測到HSP70蛋白表達(dá)明顯升高，而細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，C組小鼠腦組織和胃黏膜內(nèi)HSP70表達(dá)高于B、D組，而細(xì)胞凋亡數(shù)量低于B、D組(P<0.05，圖4)。

3討論

重型顱腦創(chuàng)傷患者在傷后數(shù)小時到數(shù)天內(nèi)即可出現(xiàn)急性胃黏膜病變，主要表現(xiàn)為胃、十二指腸黏膜的糜爛、淺潰瘍、滲血等[1]。一般認(rèn)為，重型顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生上消化道出血的原因，可能與丘腦、腦干受損后，神經(jīng)內(nèi)分泌功能紊亂，致使胃腸黏膜微循環(huán)障礙、胃酸分泌增加、黏膜屏障破壞等[4]。顱腦創(chuàng)傷后，很多患者最后死于多臟器功能障礙，而非顱腦創(chuàng)傷原發(fā)病。研究認(rèn)為，多臟器功能障礙的發(fā)生與胃腸功能障礙密切相關(guān)；顱腦創(chuàng)傷后，胃腸黏膜屏障被破壞，腸道內(nèi)的細(xì)菌及毒素移位，激發(fā)了全身免疫炎癥反應(yīng)，釋放大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加劇了全身炎癥反應(yīng)[5]。

圖2不同組間小鼠腦組織HSP70免疫陽性細(xì)胞數(shù)(A)及統(tǒng)計學(xué)比較(B)

Fig.2 Comparison of the expression of HSP70 positive cells in mouse brain(A) in different groups and the statistical comparison (B)A1：Sham(假手術(shù)組)；A2：TBI(顱腦外傷應(yīng)激性潰瘍模型組)；A3：GGA/TBI(模型組+GGA)組；A4：Saline/TBI(模型組+生理鹽水)組。與Sham組比較，*P<0.05；與TBI組比較，#P<0.05。

圖3不同組間小鼠胃黏膜HSP70免疫陽性細(xì)胞數(shù)(A)及統(tǒng)計學(xué)比較(B)

Fig.3 Comparison of the expression of HSP70 positive cells in mouse gastric mucosa (A) in different groups and the statistical comparison (B)A1：Sham(假手術(shù)組)；A2：TBI(顱腦外傷應(yīng)激性潰瘍模型組)；A3：GGA/TBI(模型組+GGA)組；A4：Saline/TBI(模型組+生理鹽水)組。與Sham組比較，*P<0.05；與TBI組比較，#P<0.05。

圖4小鼠腦組織(A1)和胃黏膜(A2)凋亡細(xì)胞染色及凋亡細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計學(xué)比較(B)

Fig.4 Comparison of the TUNEL positive cells in mouse brain (A1) and gastric mucosa (A2), and the number of TUNEL positive cells (B)

與相應(yīng)組織Sham組比較，*P<0.05；與相應(yīng)組織TBI組比較，#P<0.05。

HSP對正常細(xì)胞的穩(wěn)定生長和應(yīng)激條件下細(xì)胞的存活起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，顱腦創(chuàng)傷的程度與HSP70表達(dá)的時相及部位密切相關(guān)。輕微腦損傷1 h 后，在損傷局部皮層可以檢測到HSP70的免疫反應(yīng)性顯著增高；而在重型腦損傷后，HSP70表達(dá)的時間推遲到傷后6 h，且表達(dá)部位位于局部腦損傷深部的皮層中[6]。HSP70的表達(dá)水平與顱腦創(chuàng)傷的程度呈正相關(guān)性，且其急性期表達(dá)水平對預(yù)測預(yù)后具有臨床意義[7]。KIM等[8]在顱腦創(chuàng)傷中使用HSP70敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70轉(zhuǎn)基因小鼠在顱腦創(chuàng)傷后，與野生型小鼠相比，腦損傷的范圍較小，出血量不明顯；而相反的，HSP70敲除小鼠在顱腦創(chuàng)傷后，與野生型小鼠相比，腦損傷的范圍、出血量明顯增加，神經(jīng)行為學(xué)能力更差。這說明HSP70對顱腦創(chuàng)傷具有保護(hù)作用。

在HSP家族中，HSP70在保護(hù)胃黏膜中起重要作用。下丘腦-垂體-腎上腺軸(the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)激活時，交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，引發(fā)外周臟器應(yīng)激性反應(yīng)，其中包括胃腸黏膜。HSP70在血管內(nèi)和胃黏膜細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，能夠明顯減輕應(yīng)激性相關(guān)血流動力學(xué)障礙，緩解胃黏膜結(jié)構(gòu)的損害[9]。顱腦創(chuàng)傷后，胃黏膜組織中HSP70表達(dá)水平的明顯增高，可顯著減輕應(yīng)激后胃黏膜損傷程度，對促進(jìn)潰瘍的愈合有著積極的作用。束縛-浸水實驗?zāi)Ｐ托∈罂诜﨟SP70誘導(dǎo)劑GGA后，能誘導(dǎo)胃黏膜細(xì)胞高表達(dá)HSP70，抑制黏膜炎癥反應(yīng)，促進(jìn)潰瘍的愈合。研究證實，經(jīng)過GGA灌胃的大鼠能夠誘導(dǎo)出HSPs的表達(dá)，通過HSPs的保護(hù)作用可減輕非甾體抗炎藥物(NSAID)藥物誘發(fā)的急性胃炎病變程度[10]。

HSP70作用廣泛，可以作為一種抗凋亡的分子伴侶，控制凋亡的發(fā)生，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，主要作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞色素C的釋放、抑制凋亡蛋白酶活性因子(Apaf-1)活化、抑制caspase-3誘導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)[11]。HSP70與Apaf1結(jié)合后，抑制凋亡小體的形成，阻止了caspase-3的活化；HSP70還是糖皮質(zhì)激素受體伴侶分子，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。在HSP70存在的情況下，糖皮質(zhì)激素與受體結(jié)合后，抑制了TNFα刺激的IκBα的降解及NF-κB p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)。最近還發(fā)現(xiàn)，HSP還能與受體相互作用蛋白-3(RIP3)結(jié)合，使TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)生程序性死亡[12]。這說明在多個過程中，HSP70維持細(xì)胞的存活具有重要作用。EROGLU等[6]發(fā)現(xiàn)，HSP70基因缺失的小鼠在遭受顱腦創(chuàng)傷后，腦組織損傷的嚴(yán)重程度及神經(jīng)細(xì)胞的死亡明顯重于野生型小鼠。其可能的機(jī)制是，HSP70缺失時，ROS誘導(dǎo)的P53靶向基因Pig1、Pig8、Pig12表達(dá)明顯上升。當(dāng)使用HSP70誘導(dǎo)劑藥物Celastrol或BGP-15干預(yù)后，可以發(fā)現(xiàn)，在損傷后的第1周內(nèi)，小鼠腦損傷的程度明顯減輕，并且后期的神經(jīng)功能也能顯著改善，可能對減少后期后遺癥的發(fā)生有重要作用。

GGA是一種無毒性的HSP70誘導(dǎo)劑，經(jīng)應(yīng)激作用后，GGA可以放大HSP70對應(yīng)激的保護(hù)作用。由于其脂溶性的分子結(jié)構(gòu)，使其在顱腦創(chuàng)傷后能很容易通過血腦屏障，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。GGA可以迅速、大量誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)。ZHAO等[13]發(fā)現(xiàn)，實驗前給予小鼠口服GGA后，能夠明顯改善顱腦創(chuàng)傷后腦組織的損傷，這種保護(hù)作用與HSP70的大量表達(dá)有關(guān)。另外，GGA對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用還可能與調(diào)節(jié)熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor-1, HSF-1)，影響其他HSPs的上調(diào)有關(guān)；還可以與重要的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的釋放，減輕繼發(fā)性神經(jīng)毒性。GGA對胃黏膜的保護(hù)作用，不僅與誘導(dǎo)HSP70的大量表達(dá)有關(guān)，還參與了抑制中性粒細(xì)胞浸潤，緩解氧化應(yīng)激損傷相關(guān)[14]。

綜上所述，顱腦創(chuàng)傷后腦組織及胃黏膜內(nèi)HSP70表達(dá)上調(diào)，GGA誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)參與了創(chuàng)傷后細(xì)胞凋亡的病理生理過程。因此，GGA誘導(dǎo)HSP70可以作為保護(hù)顱腦創(chuàng)傷急性胃黏膜病變發(fā)生機(jī)制研究的靶點。

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(編輯國榮)

收稿日期：2015-08-08修回日期：2015-11-29

基金項目：甘肅省自然科學(xué)基金資助項目(No.145RJZA146)

通訊作者：任海軍. E-mail: renhaijunldey@163.com

中圖分類號：R641

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604015

Effects of heat shock protein 70 on mice with traumatic brain injury-related acute gastric mucosal lesions

YAN Gui-zhong, WANG Deng-feng, YANG Wen-zhen, LIU Ji-xing, HOU Bo-ru, REN Hai-jun

(Department of Neurosurgery, Lanzhou University Second Hospital, Lanzhou 730030, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the protective mechanism of HSP70 protein in traumatic brain injury (TBI)-related acute gastric mucosal lesions in mice. MethodsForty adult male Balb/c mice were randomly divided into sham (A), TBI (B), TBI+ geranylgeranylacetone (GGA) (C), and TBI+saline (D) groups. TBI was induced via the Feeney impact model. GGA (800 mg/kg) was administered via oral tube beginning before the model was built in group C. The expressions of HSP70 protein in brain and gastric mucosa were determined by immunohistochemistry, and the apoptotic index was detected by TUNEL method. ResultsThe injury area in mouse brain and gastric mucosa was greater in group B than in groups A and C (P<0.05). After model induction, the content of HSP70 protein in group B was markedly higher in the brain and gastric mucosa, which was notably higher than in group A (P<0.05). Obviously apoptotic cells were observed in groups B and D, which were significantly higher than in groups A and C. GGA pretreatment enhanced the up-regulated expression of HSP70 and decreased the apoptotic index distinctly; HSP70 expression was higher in group C than in groups B and D, but the apoptotic index was lower (P<0.05). ConclusionGGA can induce HSP70 protein expression in mouse brain and gastric mucosa. HSP70 is involved in the process of apoptosis inhibition. GGA can be used in the prevention and therapy of TBI-related acute gastic mucosal lesions.

KEY WORDS:traumatic brain injury (TBI); acute gastric mucosal lesions; heat shock protein 70; apoptosis

Supported by the Natural Science Foundation of Gansu Province (No.145RJZA146)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160618.2017.006.html(2016-06-18)