張　熙，婁　淼，周　樂，尉春艷

(1. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安　710004；2. 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安　710004；3. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710004)

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◇基礎研究◇

腦外傷后T型鈣通道對神經(jīng)干細胞增殖的誘導作用

張熙1，婁淼2，周樂1，尉春艷3

(1. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安710004；2. 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安710004；3. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004)

摘要：目的探討腦外傷后T型鈣通道對神經(jīng)干細胞的誘導作用及其相關機制。方法構建成年大鼠腦損傷模型，分為手術組和手術+米貝地爾組(米貝地爾組)，并另設正常對照組、假手術組。分離側腦室壁的腦室下層(subventricular zone, SVZ)細胞，用神經(jīng)干細胞懸浮培養(yǎng)法進行培養(yǎng)并鑒定其干細胞性質(zhì)；在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基中加入不同劑量的米貝地爾，通過計數(shù)神經(jīng)干細胞球、噻唑藍(MTT)法分析米貝地爾對神經(jīng)干細胞增殖抑制作用，計算米貝地爾對神經(jīng)干細胞的半抑制濃度(IC50)，Western blot法檢測腦組織中Cav3.2以及神經(jīng)干細胞中Cav3.2、Cyclin A和caspase-3的蛋白表達。結果體內(nèi)實驗表明，手術組中神經(jīng)干細胞的增殖能力顯著高于正常對照組和假手術組，應用米貝地爾腹腔注射抑制腦組織中T型鈣通道后，神經(jīng)干細胞的增殖明顯降低。體外細胞實驗表明，米貝地爾能夠明顯抑制神經(jīng)干細胞球的形成，MTT法顯示米貝地爾濃度大于5 μmol/L時，可顯著抑制細胞增殖，5、10、20 μmol/L組的吸光度(A值)與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IC50值為8.93 μmol/L。Western blot檢測結果顯示，米貝地爾組的Cav3.2蛋白和Cyclin A蛋白的表達顯著降低，caspase-3蛋白的表達顯著升高。結論腦外傷后可激活腦組織中T型鈣通道，上調(diào)神經(jīng)干細胞的增殖能力。

關鍵詞：腦外傷；神經(jīng)干細胞；T型鈣通道；米貝地爾；細胞周期；Cav3.2；Cyclin A；caspase-3

KYT WORDS: brain injury; neural stem cell; T type calcium channel; mebefradil; cell cycle; Cav3.2; Cyclin A; caspase-3

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是最常見的神經(jīng)外科疾病，往往導致長期昏迷、癱瘓、認知力下降等后遺癥，給家庭和社會造成極大的負擔。神經(jīng)干細胞能夠在不同微環(huán)境下向不同的神經(jīng)細胞分化，在損傷導致的腦功能障礙的修復中可發(fā)揮作用。但是，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞來源稀少，自我修復的能力有限，外源性神經(jīng)干細胞又面臨著成瘤性、定向誘導分化等困難。T型鈣離子通道是低電壓激活的鈣離子通道，廣泛表達于腦組織中，調(diào)控腦功能[1]。其與細胞增殖密切相關。抑制T型鈣通道表達可抑制Cyclin A、Cyclin D等細胞周期蛋白，阻斷細胞周期進程，抑制細胞增殖。有研究表明，脊髓損傷后能夠誘導T型鈣離子通道的表達上調(diào)，但在腦組織中尚無相關研究[2]。米貝地爾是特異性的T型鈣通道阻滯劑。本研究主要探討腦損傷對內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的誘導作用以及T型鈣離子通道在該過程中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑成年8周齡SD大鼠24只，清潔級，雄性，體質(zhì)量200～250 g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、重組堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)購自GIBCO公司，Nestin抗體、GFAP抗體、NSE抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，米貝地爾和caspase-3抗體購自Sigma公司，Cav3.2抗體購自Santa Cruz公司。

1.2實驗分組及動物模型的建立隨機分為正常對照組(6只)、假手術組(6只)、手術組(6只)和手術+米貝地爾組(即米貝地爾組，6只)。按文獻[3]的方法，用液壓損傷法建立可靠的動物模型，即0.12 mol/L的苯巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉(30 mg/kg)，無菌條件下，沿頭顱矢狀縫做長約1 cm正中切口，暴露顱骨外板，在頭顱立體定位儀引導下，在冠狀縫后2.3 mm，矢狀縫旁開1.5 mm的右側頂葉選取坐標點，用顱骨鉆打開顱板，顯示硬腦膜，將打擊管埋置于硬腦膜外，并用牙托水泥固定。24 h后以0.2 MPa的壓力沖擊右側頂葉皮質(zhì)，造成中度側位液壓沖擊腦損傷。假手術組不用液壓沖擊，正常對照組不進行手術。米貝地爾組每日腹腔注射米貝地爾(15 mg/kg，2次/d)，溶于含有0.5 g/L二甲基亞砜的100 μL的生理鹽水中，其余各組腹腔注射100 μL含0.5 g/L二甲基亞砜的生理鹽水。

1.3神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定術后7 d，0.12 mol/L苯巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉各組動物，以室下區(qū)為中心，迅速切取長約1.0～1.5 cm腦組織并置入冰冷的D-hanks液中，沿側腦室面切取室下區(qū)，修去損傷區(qū)附近的腦組織后，部分備做Western blot檢測，其余部分盡量剪成小于1 mm3的組織碎屑，用含1 g/L胰蛋白酶、0.67 mg/mL透明質(zhì)酸酶和0.1 mg/mL DNA酶的混合酶液，在細胞培養(yǎng)箱消化30 min，移入預先已加有等體積的1.25 g/L大豆胰酶抑制劑的離心管內(nèi)，反復吹打，銅網(wǎng)過濾并將濾液收集入離心管內(nèi)，800 r/min離心5 min，棄去上清液，用基礎培養(yǎng)基重懸沉淀細胞，800 r/min離心5 min。重復5～6次后，用神經(jīng)干細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞，經(jīng)錐蟲蘭(臺盼藍)鑒定細胞活力后，調(diào)整細胞密度約為50 000～100 000個/mL，種入培養(yǎng)瓶內(nèi)懸浮培養(yǎng)。接種24 h后更換培養(yǎng)液，以后每隔7 d半量換液。以上過程均在無菌間內(nèi)完成。

單細胞懸液行抗Nestin免疫染色檢測，鑒定是否為神經(jīng)干細胞。將培養(yǎng)獲得的神經(jīng)干細胞用含有100 mL/L胎牛血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液進行誘導，誘導結束后，檢測神經(jīng)元標記物NSE和星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP的表達，鑒定神經(jīng)干細胞的多向分化潛能。

1.4MTT檢測米貝地爾對神經(jīng)干細胞增殖的影響培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細胞克隆球用機械法傳代，取第2代細胞，獲取單細胞懸液，以1 000～10 000個/孔接種于96孔板，每孔200 μL，37 ℃孵箱(950 mL/L O2和50 mL/L CO2)培養(yǎng)24 h。按米貝地爾濃度以0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L分6組，于96孔板內(nèi)，37 ℃、950 mL/L O2、50 mL/L CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h。另設空白對照組。每組6孔。48 h后，每孔加5 mg/mL MTT液20 μL，作用4 h后，將96孔板置離心機內(nèi)1 000～2 000 r/min離心5 min，使細胞球貼壁；吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 100 μL/孔，室溫下?lián)u床震蕩10 min，酶標儀檢測各孔570 nm波長下吸光度(A值)。并根據(jù)A值計算半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)和增殖抑制率。增殖抑制率=1-(實驗孔A值-空白孔A值)/(對照孔A值-空白孔A值)。

1.5Western blot檢測Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白的表達將留取的室下區(qū)組織碎屑提取總蛋白，經(jīng)100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。封閉2 h后與兔抗鼠Cav3.2蛋白(1∶500)孵育過夜，二抗孵育1 h，化學發(fā)光顯色，以β-actin為內(nèi)參校正。

另提取獲得的神經(jīng)干細胞的總蛋白，根據(jù)IC50值在實驗組中加入米貝地爾，同時設立對照組，48 h后同上進行檢測Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白(1∶500)的表達。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，組間比較進行獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1神經(jīng)干細胞的鑒定細胞接種3 d后，培養(yǎng)瓶中可見干細胞球形成，顯微鏡下干細胞球由數(shù)十個細胞聚集而成，較緊密，大小不均等，細胞邊緣光滑、中心膨隆，形態(tài)上與簡單的細胞聚集有明顯差別；培養(yǎng)5～7 d后，這些干細胞球由數(shù)百個細胞組成，中心折光度差，色發(fā)暗(圖1)。細胞傳代后培養(yǎng)瓶中仍然可以長出類似的細胞球，且數(shù)目明顯增多，細胞碎屑明顯減少(圖2)。

圖1原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞形態(tài)Fig.1 Neural stem cell morphology in primary culture (×40)

A：原代培養(yǎng)第3天；B：原代培養(yǎng)第6天。

圖2第1次傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞形態(tài)Fig.2 Neuralstem cell morphology after the first passage (×40)

A：第1次傳代第3天；B：第1次傳代第6天。

免疫熒光檢測提示干細胞球中Nestin蛋白表達陽性。按照1.3方法進行誘導分化2 d后，可見大量細胞從干細胞球內(nèi)遷移，并開始形成短小的突起，1周后鏡下可見細胞形態(tài)成熟(圖3)。

圖3神經(jīng)干細胞誘導分化后的形態(tài)

Fig.3 Neuralstem cell morphology after induction and differentiation (×40)

A：誘導分化第1天；B：誘導分化第7天。

進一步進行免疫熒光染色，可見一部分細胞表達GFAP蛋白，一部分細胞表達NSE蛋白，提示大部分為膠質(zhì)細胞，尤以星形膠質(zhì)細胞為主，神經(jīng)元較少，散在分布，細胞突起相互間交織成網(wǎng)狀(圖4)。由此可見，所分離的細胞能夠表達神經(jīng)干細胞標志物Nestin蛋白，能夠形成干細胞球，還能夠誘導分化為膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，具備多分化潛能。因此，我們分離得到的細胞為神經(jīng)干細胞。

圖4神經(jīng)干細胞免疫熒光染色的結果

Fig.4 Immunofluorescence staining of neural stem cells (×40)

A：干細胞球的Nestin染色；B：誘導分化后GFAP染色；C：誘導分化后NSE染色。

正常對照組、假手術組和米貝地爾組獲得的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)5～7 d后，培養(yǎng)瓶中干細胞克隆球數(shù)目明顯少于手術組，且克隆球直徑小，外觀不規(guī)則(圖5)。

圖5原代培養(yǎng)第6天各組中神經(jīng)干細胞球數(shù)量及形態(tài)

Fig.5 The number and morphology of neural stem cell spheres in different groups in primary culture at day 6 (×40)

A：正常對照組；B：假手術組；C：手術組；D：米貝地爾組。

2.2米貝地爾對神經(jīng)干細胞球增殖的抑制作用按照1.4方法干預后第4天觀察各組神經(jīng)干細胞球的形成情況?？瞻讓φ战M未加米貝地爾，細胞增殖快，鏡下見大量細胞球，細胞球形態(tài)規(guī)則，邊緣光滑，中心膨隆有立體感，未見皺縮細胞及細胞碎片。隨著藥物濃度增大，鏡下細胞球數(shù)量逐漸減少，直徑也隨之減小，形態(tài)尚規(guī)則，并可見越來越多的皺縮細胞。至10 μmol/L組，鏡下僅見數(shù)十個細胞組成的小細胞球，且細胞球數(shù)目極少，周圍有大量細胞碎片。20 μmol/L組，鏡下未見正常形態(tài)的神經(jīng)干細胞及神經(jīng)球，視野中全部為死亡細胞皺縮形成的細胞碎片(圖6)。

2.3MTT檢測結果體外實驗表明，1.25 μmol/L組及2.5 μmol/L組A值較對照組稍降低，但細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義。5、10、20 μmol/L組與對照組比較，細胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計學意義，且隨著濃度增加(≥5 μmol/L)，米貝地爾對神經(jīng)干細胞的增殖抑制作用越明顯(圖7)。計算得IC50出現(xiàn)在8.93 μmol/L。

圖6加入米貝地爾后各組神經(jīng)干細胞球數(shù)量及形態(tài)

Fig.6 The number and morphology of neural stem cell spheres in each group after adding different concentrations of mibefradil (×40)

A：對照組；B：米貝地爾1.25 μmol/L組；C：米貝地爾2.5 μmol/L組；D：米貝地爾5 μmol/L組；E：米貝地爾10 μmol/L組；F：米貝地爾20 μmol/L組。

2.4Cav3.2蛋白的表達手術組中室下區(qū)組織中Cav3.2蛋白的表達顯著高于正常對照組和假手術組；米貝地爾腹腔注射后，室下區(qū)組織中Cav3.2蛋白較手術組明顯降低(圖8)。

2.5Cyclin A、Cav3.2和caspase-3蛋白的表達綜合考慮IC50值、實驗可操作性等因素后，并根據(jù)MTT檢測中加入的米貝地爾濃度，將加入神經(jīng)干細胞中的米貝地爾濃度定為距離IC50值最接近的整數(shù)值，即10 μmol/L。加入米貝地爾48 h后，Cav3.2蛋白和Cyclin A蛋白的表達明顯下調(diào)，caspase-3蛋白的表達明顯上調(diào)(圖9)。

3討論

顱腦外傷是常見的神經(jīng)外科疾病，發(fā)病突然，病情重，常常造成長期昏迷、癱瘓、認知障礙、語言功能障礙等后遺癥，給家庭和社會造成極大的負擔。神經(jīng)干細胞能在不同微環(huán)境中分化為不同的神經(jīng)細胞，可修復不同的神經(jīng)功能障礙，在顱腦外傷的治療中有光明前景[4]。目前分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的技術日趨成熟，但是，外源性神經(jīng)干細胞的應用也存在著缺陷：定向誘導分化機制尚沒有完全明確，微環(huán)境的調(diào)控技術復雜，無法完全達到按人的意志進行分化；神經(jīng)干細胞存在成瘤性[5]。因此，應用內(nèi)源性神經(jīng)干細胞，利用腦組織中天然的微環(huán)境調(diào)控其分化具備一定的優(yōu)勢。但是，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞數(shù)量稀少，遠遠不能滿足損傷修復的需要[6]。本課題組的前期研究證明，顱腦損傷后可誘導室下區(qū)神經(jīng)干細胞形成，其增殖能力明顯增加[7]，但是機制尚不清楚。

圖7加入米貝地爾后各組細胞增殖抑制率(MTT法)

Fig.7 Proliferation inhibition rate in each group after adding different concentrations of mibefradil (MTT method)

與對照組比較，1.25 μmol/L組P=0.06，2.5 μmol/L組P=0.07，5 μmol/L組P=0.001，10 μmol/L組P=0.000，20 μmol/L組P=0.000。

圖8各組室下區(qū)組織Cav3.2蛋白的表達(Western blot)

Fig.8 The expression of Cav 3.2 protein in subventricular zone in each group (Western blot)

A：正常對照組；B：假手術組；C：手術組；D：米貝地爾組。

圖9Cav3.2、Cyclin A和caspase-3蛋白的表達(Western blot)

Fig.9 Expressions of Cav3.2, Cyclin A and caspase-3 protein (Western blot)

T型鈣離子通道又名低電壓激活鈣通道，與高電壓激活鈣通道相比，具有易激活、失活緩慢、需要的電壓閾值較低等特點[8]。T型鈣通道家族包括3種T型鈣通道亞型：Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3廣泛表達于腦組織中，主要位于下橄欖核、丘腦、海馬、下丘腦、室旁核、腦干網(wǎng)狀結構、小腦深部核團、蒼白球以及丘腦底核等[9]。研究表明，Cav3.1蛋白主要位于神經(jīng)元胞體和樹突近端，Cav3.2蛋白主要位于神經(jīng)元胞體和樹突近端至中間部分，Cav3.3蛋白主要表達于特定類型細胞的胞體及樹突[10]。T型鈣離子通道主要存在于細胞的G1～S期，對細胞增殖有十分重要的作用[11-12]。外傷能夠上調(diào)細胞內(nèi)T型鈣離子通道的表達[2]。有學者認為，T型鈣離子通道蛋白也表達于胚胎干細胞中，維持干細胞的多分化潛能[13]。本研究表明，顱腦外傷后，腦組織中T型鈣離子通道的表達明顯上調(diào)，神經(jīng)干細胞的增殖能力明顯上調(diào)。米貝地爾是選擇性T型鈣離子通道阻滯劑，能夠抑制Cav3.1、Cav3.2和Cav3.3蛋白表達[14-15]。應用米貝地爾腹腔注射可抑制腦內(nèi)T型鈣離子通道的表達，腦組織內(nèi)神經(jīng)干細胞的增殖能力明顯降低。體外實驗也表明米貝地爾可抑制神經(jīng)干細胞的增殖。因此，顱腦外傷激活T型鈣離子通路對神經(jīng)干細胞有重要的誘導作用。Cyclin A的合成發(fā)生于G1期向S期的轉(zhuǎn)變過程中，在中期時消失，屬S期周期蛋白[16]。米貝地爾能夠明顯抑制Cyclin A蛋白的表達，上調(diào)caspase-3蛋白的表達，說明其可通過抑制細胞周期進展，尤其抑制是G0/G1期向S期進展，導致細胞凋亡，抑制神經(jīng)干細胞的增殖，但是具體的機制還需要進一步的研究。

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(編輯國榮)

收稿日期：2015-09-19修回日期：2015-11-29

基金項目：陜西省社會發(fā)展攻關項目資助(No.2014K11-01-01-12)

通訊作者：尉春艷. E-mail: weichy1023@163.com.

中圖分類號：R651

文獻標志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604004

T type calciumchannel activated by brain injury induces neural stem cell proliferation

ZHANG Xi1, LOU Miao2, ZHOU Le1, WEI Chun-yan3

(1. Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710004; 2. Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University, Xi’an 710004; 3. Department of Obstetrics and Gynecology,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the mechanism and induction of T type calcium channel on neural stem cells after brain injury. MethodsAdult mice brain injury model was established and divided into control, sham operation, surgery, and surgery+mebefradil groups. Neural stem cells were separated from the subventricular zone (SVZ) and identified. Moreover, we analyzed the results using MTT and neural stem cell sphere counting after adding different doses of mibefradil in culture medium, respectively. Then we calculated the half maximal inhibitory concentration (IC50) of mibefradil on neural stem cells. Finally, we analyzed the expression of Cav3.2 in SVZ and the protein expressions of Cav3.2, Cyclin A and caspase-3 in neural stem cells by Western blot. ResultsIn vivo, neural stem cell proliferation was increased in surgery group compared with that in control and sham-operation groups. The proliferation of neural stem cells in surgery+mibefradil groups was significantly decreased compared with that in surgery group after mibefradil-induced inhibition of T type calcium channel protein. In vitro, the formation of neural stem cell sphere was significantly inhibited after adding mibefradil. The cell growth ratio was significantly decreased when the concentration of mibefradil was above 5 μmol/L. A values in 5 μmol/L, 10 μmol/L and 20 μmol/L groups were significantly lower than those in control group (P<0.05). IC50 was 8.93 μmol/L. The protein expressions of Cyclin A and Cav3.2 were inhibited while that of caspase-3 was increased after mibefradil treatment. ConclusionNeural stem cell proliferation was enhanced by activating T type calcium channel after brain injury.

Supported by Shaanxi Social Development Project (No.2014K11-01-01-12)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.0917.008.html(2016-06-08)