李金潔，康吉龍，趙 英，趙 穎

（1.延邊大學臨床學院，延吉吉林 133002；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽遼寧 110016；3.吉林大學第一醫(yī)院腎病科，長春吉林 130021）

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右美托咪定對膿毒血癥大鼠腎功能及緊密連接蛋白表達的影響

李金潔1，康吉龍1，趙 英2，趙 穎3

（1.延邊大學臨床學院，延吉吉林 133002；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，沈陽遼寧 110016；3.吉林大學第一醫(yī)院腎病科，長春吉林 130021）

【摘要】目的 探討右美托咪定對膿毒血癥大鼠腎功能及緊密連接蛋白表達的影響。方法 SD大鼠30只，隨機分為右美托咪定處理組（Dex組）、膿毒血癥模型組（M組）、生理鹽水對照組（C組），每組10只。Dex組大鼠靜脈注射脂多糖（LPS）5 mg/kg，之后泵注Dex 7 μg/kg，15 min后調(diào)整劑量為5 μg/kg·h，持續(xù)泵注30 min；模型組按同樣方法給予LPS后泵注生理鹽水；C組始終采用上述方法給予生理鹽水。24 h后取血液分離血漿，多功能生化儀檢測肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量；ELISA檢測IL-1β和TNF-α含量；Western blot檢測腎組織中緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達變化。結(jié)果 與C組相比，模型組損傷較重，可見大量炎性細胞浸潤，有腎小球腎炎表現(xiàn)，而Dex組未見明顯的炎癥細胞，細胞異常較少，與模型組相比，損傷減輕。腎功能及炎性因子檢測結(jié)果顯示，與C組比較，各組血漿中Scr、BUN、IL-1β和TNF-α含量均顯著升高（P＜0.05），ZO-1和occludin蛋白表達水平均下降（P＜0.05）；與模型組比較，Dex組各項指標均明顯降低（P＜0.05），ZO-1和occludin蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。結(jié)論 右美托咪定可改善膿毒血癥所致的急性腎損傷的腎功能，抑制炎癥反應(yīng)，提升緊密連接蛋白，對腎臟有一定的保護作用。

【關(guān)鍵詞】右美托咪定；膿毒血癥；腎功能；緊密連接蛋白

膿毒血癥（septicopyemia）亦稱膿毒癥，是指由微生物及其毒素等產(chǎn)物所引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征 （systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS）［1，2］。臨床中由膿毒血癥引發(fā)的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是ICU的一個嚴重醫(yī)療問題，死亡率高達70%［3］。目前，有關(guān)AKI的防治尚缺少行之有效的技術(shù)和方法，致使膿毒血癥患者AKI的發(fā)病率和死亡率居高不下。研究表明右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）屬于α2-腎上腺素能受體（α2-AR）激動劑，具鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和穩(wěn)定循環(huán)的作用，且在缺血再灌注等多種手術(shù)方法中對心、腦、腎、肺等重要臟器還有保護作用［4］，但其潛在的分子機制仍不清楚。本研究建立膿毒血癥大鼠模型，同時給予 Dex干預(yù)，對比觀察大鼠血漿中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量變化以及腎組織中緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達變化，旨在觀察Dex對膿毒血癥大鼠急性腎損傷的保護作用，初步探討其作用機制，為臨床防治膿毒血癥損傷提供新的思路。

1　材料和方法

1.1實驗動物與分組

選取健康雄性SD大鼠30只，體重220～280 g，由延邊大學實驗動物室提供，嚴格按照延邊大學實驗動物管理辦法進行實驗，動物生產(chǎn)許可證號【SCXK（吉）2011-0009】；使用許可證號【SYXK（吉）2011-0007】。將大鼠隨機分為右美托咪定后處理組（Dex組）、膿毒血癥模型組（M組）、生理鹽水對照組（C組），每組10只。

1.2膿毒血癥大鼠模型的建立

各組大鼠于造模前禁食水6 h，腹腔注射10%水合氯醛行麻醉處理，仰臥位固定；Dex組大鼠靜脈注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（LPS from Escherichia coli 0111：B4，Sigma，L2630）5 mg/kg，之后泵注Dex 7 μg/kg，15 min后調(diào)整劑量為5 μg/kg ·h，持續(xù)泵注30 min；模型組按同樣方法給予LPS后泵注生理鹽水；C組始終采用上述方法給予生理鹽水。

1.3樣本采集與檢測

各組于LPS注入24 h后，水合氯醛麻醉，股動脈放血處死，取血液分離血漿，一部分送檢驗科用檢測肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）含量，另一部分用ELISA試劑盒（美國 R&D）檢測血漿中 IL-1β和TNF-α含量；取一側(cè)腎組織，一部分固定于福爾馬林中，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色觀察腎臟組織學變化；另一部分腎臟加RIPA裂解液，冰上超聲裂解，用Western blot法檢測腎臟中ZO-1和Occludin蛋白的表達情況。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1腎臟病理組織學變化

C組腎臟未見明顯病理組織學變化，與其相比，模型組腎臟損傷較重，可見大量炎性細胞浸潤，有腎小球腎炎表現(xiàn)；而Dex組腎臟未見明顯的炎癥細胞，細胞異常較少，與模型組相比，損傷減輕（圖1）。

2.2各組腎功能檢測結(jié)果

血漿肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）檢測結(jié)果如表1所示，與C組相比，Dex組和模型組中Scr和BUN含量顯著升高（P＜0.05）；但Dex組中Scr和BUN含量顯著低于模型組（P＜0.05）。

圖1　腎臟HE染色結(jié)果 ×200（標尺=100μm）Note.C：Control group，saline；M：Model group，injected LPS；Dex：The rats in the Dex group were given dexmedetomidine after LPS injectionFig.1 Histological changes of the rat kidneys.HE staining，×200（Bar=100 μm）

表1　腎功能檢測結(jié)果Tab.1 Results of renal function tests

2.3各組炎癥因子檢測結(jié)果

各組炎癥因子檢測結(jié)果如表2所示，與C組相比，Dex組和模型組中IL-1β和TNF-α含量顯著升高（P＜0.05）；但Dex組中IL-1β和TNF-α含量顯著低于模型組（P＜0.05）。

表2　炎癥因子檢測結(jié)果Tab.2 Results of detection of inflammatory cytokines

2.4ZO-1和Occludin的表達

與C組比較，各實驗組ZO-1和occludin蛋白表達水平均下降（P＜0.05）。與模型組比較，Dex組 ZO-1和occludin蛋白表達水平均升高（P＜0.05），見圖2和表3。

圖2　各組腎臟ZO-1和occludin表達檢測Note.C：Control group，saline；M：Model group，injected with LPS；Dex：Group Dex was given dexmedetomidine after LPS injection.Fig.2 The expression of ZO-1 and occludin in each group

表3　各組大鼠腎組織ZO-1和Occludin蛋白表達的變化（±s）Tab.3 The expressions of ZO-1 and occludin in each group

表3　各組大鼠腎組織ZO-1和Occludin蛋白表達的變化（±s）Tab.3 The expressions of ZO-1 and occludin in each group

注：與C組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05Note.*P＜0.05，compared with the control group；△P＜0.05，compared with the model group.

組別Groups　ZO-1　Occludin C組Group C　0.66±0.10　0.85±0.11模型組Group M　0.21±0.04*　0.36±0.05*Dex組Group Dex　0.48±0.06*△　0.64±0.06*△

3　討論

膿毒血癥是由多種感染因素誘發(fā)引起的劇烈的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是一種全身化膿性疾病。膿毒血癥病情較為兇險，可引起多種臟器的損傷，病死率極高，對人類健康造成了巨大威脅。在各類臟器損傷中，腎臟的損傷十分常見［5，6］。本實驗參考文獻［7］，將LPS注射大鼠建立膿毒血癥模型，大鼠24 h后死亡率高，IL-1β和TNF-α炎癥因子表達增強，心臟、肺臟、腸、腎臟等器官均有不同程度損傷，可見本實驗成功建立膿毒血癥大鼠模型。目前研究表明，由膿毒血癥引發(fā)急性腎損傷（AKI）的主要機制是腎臟的自身調(diào)節(jié)出現(xiàn)障礙，使腎臟出現(xiàn)“壓力灌注—流量灌注分離”現(xiàn)象；而炎癥反應(yīng)和多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）過度活化也參與了AKI的發(fā)?。?，8，9］。尋找能夠抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)腎灌注的措施對于降低感染性休克致AKI的發(fā)生具有重要意義。

Dex可通過抑制去甲腎上腺素的釋放，調(diào)節(jié)交感神經(jīng)張力和腎血管阻力并抑制血管加壓素分泌，改善腎血流、增加腎小球濾過率和產(chǎn)生利尿作用，從而保護了腎組織細胞和腎功能［10］。Dahmani等［11］研究結(jié)果顯示，Dex可通過改善腎臟外層髓質(zhì)血流而降低造影劑導致小鼠的腎臟損傷。此外，Dex還可激動腎小管上皮細胞的a2AR受體，而抑制抗利尿激素的釋放，增加利鈉多肽釋放和腎小球濾過，同時降低循環(huán)血漿NE水平，使腎臟血管擴張、血流量增加，從而達到腎臟的保護作用［12］。臨床上通常采用BUN和Scr來評估患者腎功能，BUN 和Scr值在正常范圍內(nèi)表明腎臟可以排出體內(nèi)廢物，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，當腎臟發(fā)生損傷時，這兩個指標會出現(xiàn)異常。本研究在建立膿毒血癥大鼠模型的基礎(chǔ)上給予Dex干預(yù)，從病理組織學和血漿中BUN和Scr指標變化來評估腎功能，結(jié)果模型組腎臟損傷較重，Dex干預(yù)后異常細胞明顯減少，在一定程度上減輕LPS致大鼠近端和遠端小管超微結(jié)構(gòu)的改變，且BUN和Scr濃度明顯降低。提示Dex對膿毒血癥大鼠腎功能有一定的保護作用。

膿毒血癥上皮細胞是細胞因子作用的靶點，LPS可致管周毛細血管功能障礙及腎小管上皮細胞損傷。有研究顯示，Dex可通過抑制脫乙?；附M蛋白HDAC2和HDAC5表達，從而減少促炎細胞因子，降低炎癥反應(yīng)，而提高膿毒血癥大鼠的生存率［13］。持續(xù)輸注Dex可減輕腎缺血/再灌注（I/R）損傷，提高對腎損傷的耐受性［14，15］。本研究表明，Dex可減輕LPS所致血清炎性因子TNF-α和IL-6水平的升高，提示Dex對膿毒癥誘發(fā)的炎性反應(yīng)有一定的抑制作用。

緊密連接在腎發(fā)育過程—腎單位形成中發(fā)揮重要的作用。研究表明，在缺血性損傷、自由基損傷及ATP缺失的情況下，各種組織的緊密連接蛋白斷裂，表達發(fā)生改變，且緊密連接蛋白調(diào)控腎小管細胞旁通透性。ZO-1作為緊密連接的組織者，可介導信號轉(zhuǎn)導和蛋白間的相互作用；Occludin與其對細胞膜的調(diào)節(jié)有關(guān)，可增加其對低分子量分子的細胞旁通透性［16，17］。本研究結(jié)果表明，膿毒血癥大鼠腎組織緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達明顯下降，而一定劑量的Dex在一定程度上可上調(diào)由膿毒血癥致大鼠腎組織緊密連接蛋白 ZO-1和occludin的表達。

綜上所述，Dex可減輕膿毒血癥引起的腎組織炎癥反應(yīng)，改善腎功能，且上調(diào)腎組織緊密連接蛋白ZO-1和occludin蛋白的表達，上調(diào)腎組織緊密連接蛋白表達可能是其發(fā)揮的保護作用的機制之一。

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〔修回日期〕2016-02-22

Effect of dexmedetomidine on the renal function and expression of tight junction protein ZO-1 and occludin in the kidney of rats with septicopyemia

Li Jin-jie1，Kang Ji-long1，Zhao Ying2，Zhao Ying3
（1.Yanbian University，Yanbian，Jilin 133002，China；2.Shenyang Military General Hospital of Shenyang District，Shenyang 110016；3.the First Hospital of Jilin University，Changchun 130021）

【Abstract】Objective To investigate the effect of dexmedetomidine on the renal function and the expression of tight junction protein ZO-1 and occluding in the kidney of rats with septicopyemia induced by lipopolysaccharide.Methods Thirty adult male SD rats were randomly divided into 3 groups（n=10 each）：control group（group C），LPS group（group M），and dexmedetomidine group（group Dex）.In the groups Dex and LPS，the rats were infused with saline and lipopolysaccharide（5 mg/kg，i.v.）respectively.In the Dex group，after intravenous injection of lipopolysaccharide（5 mg/kg），the rats were firstly infused the loaded dose of dexmedetomidine（7 μg/kg）for 15 minutes，and then changed to5 μg/kg·min for 30 minutes.Blood samples were collected at 24 h later for measuring TNF-α，IL-1β，Scr and BUN.The kidney tissues were examined by histopathology.The expression of ZO-1 and occludin was detected by Western blot. Results Compared with the group C，the kidney tissue of group M was extensively damaged with tubular dilatation and inflammation，while reduced in the group Dex.Compared with the group C，the expressions of Scr，BUN，IL-1β and TNF-α were all enhanced in the groups M and Dex（P＜0.05），while the inflammatory factors in the group Dex were significantly lower than those of the group M（P＜0.05）.The Results The Western blot analysis showed that the expressions of protein ZO-1 and occludin in the group Dex were significantly higher than those of the group M（P＜0.05）. Conclusions Dexmedetomidine can improve the renal function of rats with septicopyemia，inhibit the acute renal injury and inflammation，increase the expression of protein ZO-1，and exert certain protective effect on the kidneys.

【Key words】Dexmedetomidine；Septicopyemia；Renal function；Occludin；ZO-1；Kidney；Rat

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0014-04

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.003

［作者簡介］李金潔（1994-），女，主要研究方向：麻醉學，E-mail：lijinjie1994@163.com。

［通訊作者］康吉龍，1961年12月，碩士，主任醫(yī)師，麻醉科副主任，麻醉學專業(yè)，E-mail：15526770722@163.com。