吳 方，余陳歡，張歡歡，馬 月，俞 冰，應(yīng)華忠

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州浙江 310053；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州浙江 310013）

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線粒體-細(xì)胞色素C途徑在兔非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞凋亡中的作用

吳 方1，余陳歡2，張歡歡2，馬 月2，俞 冰1，應(yīng)華忠2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州浙江 310053；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實(shí)驗(yàn)動物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州浙江 310013）

【摘要】目的 探討線粒體-細(xì)胞色素C途徑在兔非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）肝細(xì)胞凋亡中的作用。方法 雄性日本大耳兔40只，隨機(jī)分為正常對照組（8周）和NAFLD模型組（4、6、8周組），每組各10只。模型組按1.2 mL/kg皮下注射花生油，2次/周，建立日本大耳兔NAFLD模型。按各組時(shí)間點(diǎn)處死兔子，測定兔血清中生化指標(biāo)水平；HE染色觀察肝組織病理形態(tài)改變，流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞凋亡率；提取肝臟線粒體，分光光度法檢測線粒體通透轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的狀態(tài)變化；免疫組織化學(xué)法檢查Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C和caspase-3在肝組織中的表達(dá)情況；Western blot檢測細(xì)胞色素C以及caspase-3含量變化。結(jié)果 與正常對照組相比，模型組肝臟脂質(zhì)代謝指標(biāo)和相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平升高，模型組肝細(xì)胞凋亡率與對照組比較顯著增加（P＜0.01）。造模4周時(shí)出現(xiàn)肝功能損傷，脂質(zhì)代謝紊亂，隨著NAFLD病程的發(fā)展，Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C和caspase-3表達(dá)量逐漸增加，線粒體通透轉(zhuǎn)換孔開放率隨高脂飲食飼養(yǎng)時(shí)間延長明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論 線粒體-細(xì)胞色素C途徑在NAFLD引起的肝細(xì)胞凋亡中起到了一定的調(diào)控作用。

【關(guān)鍵詞】非酒精性脂肪肝；凋亡；細(xì)胞色素C；胱冬肽酶-3；線粒體通透轉(zhuǎn)換孔；

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是臨床現(xiàn)今常見非傳染性肝病之一［1］。依據(jù)其病變肝組織炎癥反應(yīng)和纖維化的有無及發(fā)展程度，NAFLD涵蓋了單純性脂肪肝以及由其演變的非酒精性脂肪肝炎、肝纖維化和肝硬化等疾?。?］。據(jù)報(bào)道隨著生活水平的提高，我國NAFLD的患病率逐年增加，已成為我國第二大肝病［3］，嚴(yán)重威脅人類健康，受到人們的普遍重視。

既往的研究已證實(shí)，肝細(xì)胞凋亡在NAFLD發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段普遍存在［4，5］。細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)形式是細(xì)胞核的變化，而細(xì)胞質(zhì)中線粒體的變化則是引起凋亡的重要誘因。研究表明NAFLD患者存在線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷［6］，且隨著病變程度加深，線粒體功能損傷越明顯［7］。作為日益受到重視的細(xì)胞凋亡調(diào)控器，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中的中心地位得到確認(rèn)。目前NAFLD研究最常用的大鼠模型在血脂代謝方面也與人類NAFLD特征有所區(qū)別［8，9］，課題組前期通過花生油皮下注射誘導(dǎo)日本大耳兔建立NAFLD動物模型，具有造模時(shí)短、成型快，肝臟取材量大，死亡率低等優(yōu)點(diǎn)，可簡化實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本［10］。本研究通過建立日本大耳兔NAFLD模型，探討線粒體-細(xì)胞色素C途徑在非酒精性脂肪肝肝細(xì)胞凋亡中的作用。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

雄性日本大耳兔40只，體重（2.0±0.2）kg。由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供［SCXK（浙）2009-0039］；所有實(shí)驗(yàn)在浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行［SYXK（浙）2008-0114］。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑、儀器

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；線粒體抽提試劑盒購于北京達(dá)美基因有限公司；兔C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒，均購于上海拜沃公司；花生油（飽和脂肪酸：單不飽和脂肪酸：多不飽和脂肪酸=0.27∶1∶1），購于東莞市鵬發(fā)糧油有限公司；其余所用試劑均為分析純。

5424型高速冷凍離心機(jī)，艾本德中國有限公司；723N型可見分光光度計(jì)，上海精密科技有限公司；DM2500型熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，萊卡儀器有限公司；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動物分組及造模：40只日本大耳兔隨機(jī)分為兩組，分別為正常對照組和NAFLD模型組，其中正常對照組取8周為時(shí)相點(diǎn)，模型組取4周、6周、8 周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各10只。模型組分別皮下注射花生油4周、6周、8周，2次/周，每次1.2 mL/kg，建立日本大耳兔NAFLD模型。正常對照組隔天注射同體積的生理鹽水。

1.3.2取材：于末次造模后禁食12 h，取各相時(shí)點(diǎn)日本大耳兔，采用耳動脈取血，速眠新麻醉后頸動脈放血處死。3 500 r/min離心10 min分離血清-80℃保存?zhèn)溆?。取同一部位肝組織置于4%中性甲醛中固定，用于病理切片，以試劑盒方法提取肝組織線粒體，其余肝組織置于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3指標(biāo)測定：采用比色法測定血清TC、TG含量，ELISA法測定血清CRP、IL-6、TNF-α含量，具體操作步驟均按說明書進(jìn)行。流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞凋亡率。

線粒體通透轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的檢測按試劑盒說明書進(jìn)行，在分光光度計(jì)（440 nm）下獲取0 min、30 min和60 min的吸光值（A），計(jì)算A比值，若A值比值降低，表明MPTP活性增強(qiáng)。

1.3.4 病理學(xué)觀察：石蠟包埋的肝組織標(biāo)本制備4 μm切片，依次用自來水和蒸餾水洗，蘇木精液染核5 min，再充分水洗和蒸餾水洗，然后用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻后再用1%磷鉬酸水溶液分化3 min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)染5 min，最后以0.2%冰醋酸溶液浸洗片刻，95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。在光鏡下觀察肝組織病理變化。

1.3.5免疫組織化學(xué)分析：免疫組化觀察Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C和caspase-3在肝組織表達(dá)情況。石蠟包埋肝組織切片脫蠟至水；3%過氧化氫孵育37℃孵育30 min后，再用5% ～10%正常山羊血清封閉孵育后棄血清；滴加一抗工作液37℃孵育1～2 h，沖洗后滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，再沖洗后加適量堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，最后沖洗加顯色劑顯色后充分沖洗復(fù)染脫水封片，光鏡下觀察。

1.3.6Western-Blot分析：取相同部位肝組織200 mg加入含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，4℃勻漿，10 000 r/min離心15 min取上清液。上清蛋白定量，取50 μg蛋白，變性后行聚丙酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，6%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗滌后加入兔抗鼠caspase-3（1∶500）或細(xì)胞色素C抗體（1∶250），4℃過夜，洗滌，加入辣根過氧化酶結(jié)合的抗兔IgG（1∶4000），化學(xué)發(fā)光試劑檢測，X線片顯影。采用條帶圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值，所測結(jié)果為扣除背景的積分光密度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1血清生化指標(biāo)的分析

與對照組相比較，模型組各時(shí)段血清中 TC、TG、CRP、IL-6、TNF-α的值均升高，且顯時(shí)間依賴性，到第8周達(dá)到最大值，差異有顯著性（P＜0.01），其中代表脂質(zhì)代謝水平的TC、TG在第4周即出現(xiàn)顯著升高（P＜0.01），見表1。表明造模4周后即出現(xiàn)肝脂質(zhì)代謝紊亂，炎癥因子表達(dá)上升，且隨造模時(shí)間的延長而加重。

2.2肝組織病理形態(tài)觀察

對照組兔肝臟肉眼觀察無明顯異常，模型組兔第4周肝臟為色紅，質(zhì)脆。6～8周肝臟被膜緊張、邊緣圓鈍、切面油膩、色淡黃，表面有花斑，質(zhì)軟。HE染色檢查，觀察到正常對照組兔肝組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核大而清晰，胞質(zhì)豐富，肝細(xì)胞無變性、壞死。模型組4周兔肝組織呈輕度脂肪病變，部分肝細(xì)胞胞漿內(nèi)有大小不等的脂肪空泡；模型6周組兔肝組織細(xì)胞出現(xiàn)腫脹多于4周組，細(xì)胞核大小不均，被脂肪空泡擠向一側(cè)；模型8周組絕大部分肝細(xì)胞有脂肪空泡（圖1）。表明隨著造模時(shí)間的延長，兔肝細(xì)胞的病變程度進(jìn)一步加重。

2.3各組MPTP活性比較

在30 min/0 min和60 min/0 min的OD值比較中，模型組各個(gè)時(shí)相的MPTP活性隨著時(shí)間的延長而增強(qiáng)，且與對照組比較差異具有顯著性（P＜0.01），表2。

表1　NAFLD兔血清相關(guān)生化指標(biāo)的變化（n=10）Tab.1 Changes of biochemical indexes in the NAFLD rabbits

圖1　肝病理學(xué)變化（HE染色，標(biāo)尺=100 μm）Fig.1 Pathological changes of liver in the NAFLD rabbits（HE staining，Bar=100 μm）

表2　NAFLD兔肝組織細(xì)胞MPTP的變化（n=10）Tab.2 The changes of MPTP in the liver cells of NAFLD rabbits（n=10）

2.4肝細(xì)胞凋亡檢測

由圖2流式細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在0.8 mL/kg花生油連續(xù)注射4周、6周和8周后，肝細(xì)胞凋亡率分別為13.0%、18.9%和23.1%，與空白對照組（凋亡率3.0%）相比較，差異均具有明顯的顯著性（均P＜0.01），并呈明顯的量效關(guān)系，提示0.8 mL/kg花生油連續(xù)注射可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡。

2.5免疫組織化學(xué)分析

Bcl-2主要在胞漿內(nèi)著色，偶見核膜著色。4周組Bcl-2與正常組相比不顯著，棕黃色分布幾乎一樣多，隨著時(shí)間的推進(jìn)，6周組和8周組的Bcl-2表達(dá)量有了明顯的增加（圖3）。Bax主要在胞漿內(nèi)著色，模型組大鼠Bax的表達(dá)依時(shí)間的延長而遞增。4周組Bax主要在脂肪變性肝細(xì)胞呈棕黃色顆粒狀；6周組與4周組相比較陽性細(xì)胞數(shù)增多、染色加深；8周組陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多，在脂肪病變明顯的肝細(xì)胞胞漿內(nèi)呈黃褐色表達(dá)，而相對的脂肪病變程度輕的肝細(xì)胞則為黃棕色（圖4）。模型組大鼠隨造模時(shí)間延長，肝臟病變加深，被染色陽性細(xì)胞數(shù)增多，顏色越深，肝組織Bax的表達(dá)量逐步升高。

正常組大鼠細(xì)胞色素C和caspase-3的表達(dá)為個(gè)別肝細(xì)胞胞漿內(nèi)弱陽性表達(dá)；模型組4周可見肝小葉內(nèi)散在陽性表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀；6周組和8周組細(xì)胞色素C和caspase-3兩者的陽性細(xì)胞顯著增加，呈棕褐色片狀強(qiáng)陽性表達(dá)，且分布與脂肪肝的嚴(yán)重程度相一致（圖5、6）。

2.6Western blot分析

模型組與正常組caspase-3和細(xì)胞色素C蛋白的Western blot檢測結(jié)果見圖7，1至4依次為正常組、4周組、6周組和8周組。以各待測條帶與其相應(yīng)內(nèi)參actin蛋白的灰度值比值做統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，模型組與正常組相比caspase-3和細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)明顯增加，隨脂肪肝程度的加重，逐漸增高。

圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測肝細(xì)胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate of hepatocytes detected by flow cytometry

圖3　Bcl2在各組動物肝組織表達(dá)情況（標(biāo)尺=100 μm）Fig.3 The expression of Bcl-2 in the liver of the NALFD rabbits.（Bar=100 μm）

圖4　Bax在各組動物肝組織表達(dá)情況（標(biāo)尺=100 μm）Fig.4 The expression of Bax in the liver tissue of the NALFD rabbits.（Bar=100 μm）

圖5　細(xì)胞色素C在各組動物肝組織表達(dá)情況（標(biāo)尺=100 μm）Fig.5 Expression of cytochrome c in the liver tissue of the NALFD rabbits.（Bar=100 μm）

3　討論

細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶和信號傳導(dǎo)途徑等共同調(diào)控的一個(gè)激活過程，胱冬肽酶（caspase）處于細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵地位［11］。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡信號的執(zhí)行者，它的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在細(xì)胞凋亡早期的啟動與執(zhí)行過程中起著重要作用。此外，在細(xì)胞凋亡過程中，MPTP的異常開放可導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化解耦聯(lián)、ATP衰竭、線粒體腫脹及內(nèi)膜嵴消失，從而促使細(xì)胞色素C和相關(guān)凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)，活化凋亡蛋白家族的主要成員胱冬肽酶，觸發(fā)瀑布式級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。

本實(shí)驗(yàn)成功建立兔NAFLD模型，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡指數(shù)與NAFLD模型中肝臟脂肪病變及炎癥程度成正相關(guān)，隨著脂肪肝程度以及肝細(xì)胞炎癥、壞死的加重，其肝細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增高，與國外研究的結(jié)果相一致［5，7］。MPTP開放增加幅度與肝臟病變程度成正相關(guān)。免疫組化及 Western blot顯示Bcl-2、Bax蛋白在NAFLD肝細(xì)胞中的表達(dá)與正常對照組比較均有所增加，二者被誘導(dǎo)活化；但Bax較Bcl-2蛋白的表達(dá)量增加明顯，Bcl-2/Bax比值進(jìn)行性降低。可推測Bax蛋白上調(diào)以及Bcl-2/ Bax比例失調(diào)可能是MPTP開放、線粒體損傷，促使肝細(xì)胞凋亡的重要原因之一。另外，Caspase-3和細(xì)胞色素C的表達(dá)量隨NAFLD病程的發(fā)展而升高，提示caspase-3被激活以及由MPTP開放引起的細(xì)胞色素C的釋放增加與非酒精性脂肪肝引起的肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，參與了非酒精性脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展。上述闡明了線粒體-細(xì)胞色素C途徑在非酒精性脂肪肝兔肝細(xì)胞凋亡中的作用，為進(jìn)一步探明NAFLD可能的發(fā)病機(jī)制，阻斷NAFLD進(jìn)展提供了理論依據(jù)。

圖6　Caspase-3在各組動物肝組織表達(dá)情況（標(biāo)尺=100 μm）Fig.6 Expression of caspase-3 in the liver tissue of NALFD rabbits.（Bar=100 μm）

圖7　Caspase-3和細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)Fig.7 Expression of caspase-3 and cytochrome c proteins in each group of the rabbits.

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〔修回日期〕2016-01-22

Effect of mitochondrial cytochrome c on hepatocyte apoptosis in non-alcoholic fatty liver disease in rabbits

WU Fang1，YU Chen-huan2，ZHANG Huan-huan2，MA Yue2，YU Bing1，YING Hua-zhong2
（1.School of Pharmaceutics，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2.Zhejiang Key Laboratory of Experimental Animal and Safety Evaluation，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013）

【Abstract】Objective To investigate the role of mitochondrial cytochrome c on hepatocyte apoptosis in nonalcoholic fatty liver disease in rabbits and its pathogenesis.Methods Forty Japanese white rabbits were randomly assigned to control group and model group.The model group was divided into three subgroups：4-week，6-week，and 8-week groups，with 10 rabbits in each group.The model groups were subcutaneously injected with peanut oil（1.2 mL/kg），twice a week for 4 weeks，6 weeks or 8 weeks.The rabbits of all groups were killed at the right time.Serum samples were collected to detect the serum biochemical index levels.Liver tissue samples were taken for pathological observation using HE staining.The hepatocyte apoptosis index（AI）was measured by flow cytometry，and mitochondrial permeabilitytransition pore（MPTP）was evaluated by ultraviolet spectrophotometry.Immunohistochemistry was employed to detect the hepatic expressions of Bcl-2，Bax，CYT C and caspase-3.Western blot was performed to detect the changes of CYT C and caspase-3 protein expressions.Results The model groups showed hepatic injury and high level of TC，TG，CRP，IL-6 and TNF-α beginning from 4 weeks.With the NAFLD process，the hepatocyte apoptosis index was significantly increased at 4-8 weeks and the MPTP was gradually increased.In the model group，hepatic Bcl-2，Bax，CYT C and caspase-3 expressions were increased steadily with the time passing.Conclusions NAFLD-induced liver damage is associated with apoptosis，and the mitochondrial cytochrome c-mediated apoptotic pathway plays a role in the occurrence of NAFLD.

【Key words】Non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）；Apoptosis；Cytochrome c；Caspase-3；Mitochondrial permeability transition pore（MPTP）；Rabbit

【中圖分類號】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）04-0007-07

doi：10.3969.j.issn.1671-7856.2016.04.002

［基金項(xiàng)目］國家自然基金資助項(xiàng)目（81573591）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011C37095）。

［作者簡介］吳方（1989-），男，研究方向：疾病動物模型研究。Email：hnwufang@163.com。

［通訊作者］應(yīng)華忠（1968-），男，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物學(xué)。Email：fellycook2002@163.com。